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目的探索中国人乳头状甲状腺癌RET基因重排、BRAF突变、H4-PTEN基因重排的发生情况及其临床病理相关性,研究DNA双链断裂修复基因XRCC3的多态性与乳头状甲状腺癌的遗传易感性和基因重排发生的相关性。材料与方法第一部分143例甲状腺肿瘤组织、瘤旁正常组织的RNA抽提及逆转录合成cDNA,其中包括6例结节性甲状腺肿,2例滤泡性腺瘤,7例甲状腺髓样癌和126例乳头状甲状腺癌。以cDNA为模板进行RET基因重排方式RET/PTC-1、RET/PTC-2、RET/PTC-3、ELKS/RET的PCR扩增和测序鉴定。对RET重排阳性和阴性的病人的临床病理特点进行分析。第二部分125例乳头状甲状腺癌组织、癌旁正常组织RNA和基因组DNA的抽提,以RNA为模板合成cDNA。以DNA为模板进行BRAF外显子PCR扩增及测序鉴定,比对癌及癌旁正常组织的序列,进行BRAF的突变分析。以cDNA为模板进行H4与PTEN基因重排产物的PCR扩增,测序鉴定,根据H4/PTEN的重排方式,设计PTEN/H4引物进行回复性重排的PCR扩增和测序鉴定。综合分析RET重排、H4-PTEN重排、BRAF突变在乳头状甲状腺癌的发生情况及其与临床病理之间的相关性和生物学意义。第三部分173例乳头状甲状腺癌病人以及120名正常对照群体血样基因组DNA的抽提,以DNA为模板进行DNA双链断裂修复基因XRCC3外显子的PCR扩增。运用DGGE（变性梯度凝胶电泳,Denatured Gradient Gel Electrophoresis）对PCR产物进行突变分析。根据DGGE结果,对阳性的外显子PCR产物进行测序鉴定。基于病人和正常人的XRCC3多态性的病例-正常对照分析,进行XRCC3多态性与乳头状甲状腺癌的遗传易感性的相关性研究。基于基因重排阳性病人和基因重排阴性病人的XRCC3基因多态性差异的病例之间对照分析,进行DNA双链断裂修复基因与基因重排的相关性分析。结果第一部分在126例乳头状甲状腺癌组织中,发现了18例（14.3%）RET基因重排,包括12例RET/PTC-1和6例RET/PTC-3,癌旁正常甲状腺组织、非乳头状甲状腺癌肿瘤组织未发现RET重排,所有组织没有发现RET/PTC-2、ELKS/RET重排。RET重排在年龄＜20岁、20-40岁和≥40岁三组中的概率分别为:50%、14.6%和11.1%,年龄＜20岁的群体的RET重排的概率最高（P=0.033）。RET/PTC-1阳性的病例更容易在良性甲状腺疾病的基础上伴随乳头状甲状腺癌（P=0.021）,尤其是甲状腺炎的基础上;RET/PTC-3阳性的病例具有高的甲状腺外侵犯的特点（P=0.005）,同时其分期也相对较晚（P=0.007）。通过多因素的回归分析,RET重排（OR=8.703,95%CI 1.690-44.818）,男性（OR=3.875,95%CI 1.405-10.685）,年龄（OR=0.964,95%CI 0.933-0.996）,多灶性（OR=3.543,95%CI 1.333-9.416）和晚期的T分类（OR=7.318,95%CI2.910-18.400）是乳头状甲状腺癌颈侧区（Ⅱ-Ⅴ区）淋巴结转移的高危因素。第二部分在125例乳头状甲状腺癌中,58例发现了BRAF突变V600E（46.4%）,12例为RET/PTC-1（9.6%）,6例为RET/PTC-3（4.8%）,6例H4/PTEN重排（4.8%）,7例发现了PTEN/H4重排（5.6%）。在BRAF突变阳性的病人中,11例（19.0%）同时检测出了一种或者多种的重排,同时在RET/PTC和H4-PTEN阳性的样本中,发生另外一种突变的概率分别为38.9%（7/18）和75%（9/12）,多重分子改变群体比单种分子病理改变和没有分子病理改变的病人发病年龄要轻（P=0.019）。在发生重排的四种基因里,H4基因（CCDC4）,也就是形成RET/PTC-1和H4-PTEN的基因,是最常见的涉及重排的基因（17.6%,22/125）。基因重排阳性的乳头状甲状腺癌的病人的发病年龄比那些没有基因重排的病人要年轻（36.81±12.416 VS 43.53±13.890,P=0.025）,在年龄小于20岁的病人中,拥有最高的基因重排的发生率（50%）,在年龄≥60岁的病人中,BRAF突变是唯一一个检测出的分子改变（81.8%）。基因重排的发生率随着年龄的增大而减少,而BRAF突变的发生率随着年龄的增大而增大。重排阳性的病人比阴性的病人具有更高的淋巴结转移的可能（92.6%VS 70.4%,P=0.018）。第三部分根据XRCC3（AF037222）的序列,共发现了6种多态性位点6390G＞T（位于5’-UTR）、6410A＞G（dSNP登录号:rs56377012）、14242G＞A（Val165Ile）、14304C＞T、14362T＞C、18440C＞T,6410A＞G和14304C＞T的杂合度（Heterozygosity）相对较高,在正常人群均为2.5%,正常人群中野生型等位基因的基因频率均为98.8%,其它4种多态性均为少见突变。6410A＞G和14304C＞T所显示的基因频率和基因型频率符合Hardy-Weinburg Equilibrium（P＞0.05）。6410A＞G的G等位基因与乳头状甲状腺癌的发病相关（基因频率在病例和对照分别为4.3%和1.3%）,P值为0.033,OR值为3.580（95%CI,1.025-12.505）。由6410A＞G和14304C＞T两个多态性位点构成的单倍型（haplotype） A6410C14304为常见单倍型,在对照和病例中的发生率为97.5%与93.1%,与少见单倍型(A6410T14304,G6410C14304,G6410T14304)相比,A6410C14304单倍型对乳头状甲状腺癌的发生具有明显的保护性作用,P值为0.017（OR 2.907,95%CI 1.170-7.224）。XRCC3 6410A＞G的A/G和GG型个体所患甲状腺癌组织的RET重排率高于AA型个体的RET重排发生率（25%V.S.14%）,但差异没有统计学意义（P=0.335）。结论第一部分本研究中中国人乳头状甲状腺癌仅存在RET/PTC-1和RET/PTC-3两种重排方式,在年龄＜20岁的病人群体,RET重排的概率是50%,明显高于其它的年龄群体;RET重排同乳头状甲状腺癌Ⅱ-Ⅴ区淋巴结密切相关,RET/PTC、男性、发病年龄早、多发病灶、晚期的T分类被证实为乳头状甲状腺癌侧颈部淋巴结转移的高危险因素,应当对RET/PTC阳性乳头状甲状腺癌的病人的侧颈部进行更详细的术前评估和术后随访。我们推测RET/PTC-1和RET/PTC-3在甲状腺癌的演进方面具有不同的作用,RET/PTC-1可能在乳头状甲状腺癌与甲状腺炎的相关性方面具有一定的作用。第二部分基因重排的发生率随着年龄的增大而减少,而BRAF突变的发生率随着年龄的增大而增大,是年龄≥60岁的病人中唯一被检测出的分子改变（81.8%）。RET重排,BRAF突变和H4-PTEN重排可以发生在同一个乳头状甲状腺癌的标本,这种多重分子病理改变容易在年轻的病人中发生。联合检测RET/PTC、BRAF突变、H4-PTEN和其他的涉及乳头状甲状腺癌分子改变的危险因素,将会提高分子标记作为一种诊断指标和靶向治疗指标的预测意义。第三部分XRCC3基因6410A＞G（rs56377012）G等位基因与乳头状甲状腺癌的发病相关,与另外一个SNP 14304C＞T进行的单倍型分析,发现常见单倍型A6410C14304与其他少见单倍型相比,对乳头状甲状腺癌的发生具有明显的保护性作用。6410A＞G的A/G和GG型个体发生RET基因重排的概率高于AA型个体的重排发生率。这些基因多态性对乳头状甲状腺癌发病的影响机制,可能是由于多态性自身作为致病因素,或者可能是由于该多态性位点与另外一个致病性多态性位点处于连锁不平衡的结果,尚需进一步实验来证实。