【研究背景】孤独症谱系障碍（Autism spectrum disorders,ASD）,简称孤独症,是一组复杂的神经发育障碍疾病,其核心特征是社交障碍和重复刻板行为。ASD常伴发多种共病,其中癫痫最为常见。研究表明,ASD患者中癫痫共患达20%。许多ASD高风险基因突变导致ASD的同时会引起癫痫产生或易感性增加。MECP2是一种ASD致病基因,其缺失和重复复制均会出现孤独症癫痫共患的情况。癫痫是临床上最常见的神经系统疾病之一,以反复发作、异常同步化神经元放电为主要特征。8%的癫痫患者出现孤独症的临床表现,提示ASD和癫痫存在共有致病机制。癫痫致病机制的研究依赖于动物模型。目前的癫痫动物模型可分为化学药物点燃和电刺激点燃模型,这两种模型可以部分模拟临床癫痫表型,但其导致癫痫发作的机制比较复杂。兴奋-抑制失衡（Excitation/Inhibition imbalance）是癫痫和ASD发病的重要假说,我们认为特异性地调控某一类神经元的活性导致E/I失衡的癫痫模型更适用于孤独症中癫痫产生机制的研究。化学遗传学方法可以精确提高或降低特定类型神经元的活性,成为研究神经系统功能及相关疾病有力的工具。根据兴奋-抑制失衡在癫痫发病机理中的重要作用,本课题采用化学遗传学方法选择性在颞叶癫痫致病关键脑区--海马,抑制其中间神经元活动,造成小鼠海马兴奋-抑制失衡,从而在野生型小鼠上成功建立了癫痫发作模型（Interneuron DREADDs,iDREADDs癫痫模型）。我们证实了孤独症模型--Me CP2Tg1小鼠在iDREADDs癫痫模型中癫痫易感性增高。进一步研究表明,Me CP2Tg1小鼠确实存在抑制性中间神经元的丢失和形态的异常,提示海马抑制性中间神经元异常在该孤独症小鼠癫痫产生中起到重要作用。综上所述,通过特异性调控特定类型细胞活性的iDREADDs癫痫模型,为从细胞、脑环路水平上探究孤独症中癫痫的产生机制提供新思路。【研究目的】1.构建基于兴奋-抑制失衡假说的iDREADDs小鼠癫痫模型。2.利用该模型探究孤独症模型Me CP2Tg1小鼠的癫痫易感性。3.探究Me CP2Tg1小鼠癫痫易感性增高的细胞形态学机制。【研究方法】1.通过脑立体定位技术在小鼠海马抑制性中间神经元中表达iDREADD s蛋白h M4Di,并在抑制性神经元中表达GFP蛋白的GAD67-GFP小鼠来确定病毒感染的特异性;2.在iDREADDs小鼠癫痫模型颅骨植入EEG记录电极,通过在腹腔注射不同浓度的DREADD蛋白特异性激动剂--C21,进行EEG和视频同步采集观察动物癫痫产生的情况;3.通过c-Fos染色计数以及GFAP,Flouro-Jade C,Neu N染色计数判断iDREADDs小鼠癫痫模型与传统经典海人酸（KA）小鼠癫痫模型在癫痫产生后的病理差异;4.通过在体光纤钙成像技术,观察iDREADDs小鼠模型癫痫发作时海马神经元活性的改变;5.使用iDREADDs癫痫模型,观察Me CP2Tg1和WT小鼠是否存在癫痫发作的差异;6.结合神经元稀疏标记-共聚焦成像-神经元3D重构技术,观察Me CP2Tg1和WT小鼠海马不同类型神经元的形态、结构差异。【结果】1.在GAD67-GFP小鼠中,表达iDREADDs蛋白的神经元与GFP+神经元共标率达80%以上。2.癫痫诱导后,iDREADDs癫模型组在海马神经元（c-Fos阳性细胞）激活数量上明显高于对照组而略低于KA癫痫组;海马神经元数量（Neu N阳性细胞）无明显差异;未出现神经元损伤（Flouro-Jade C染色）;星形胶质细胞的数量显著增高（GFAP染色）。3.iDREADDs癫痫模型中,与WT小鼠相比,Me CP2Tg1小鼠癫痫发作次数增多,癫痫发作持续时间增长以及癫痫发作后死亡率增高。4.与WT组小鼠相比,Me CP2Tg1小鼠海马PV阳性抑制性神经元的数量显著下降,树突分支复杂性显著降低;海马齿状回（DG）锥体神经元的树突分支复杂性增高,树突棘总密度增高;CA1区锥体神经元树突分支复杂性降低,树突棘总密度显著增高。【结论】1.通过化学遗传学方法特异性地降低海马抑制性中间神经元活性,可以成功诱导小鼠癫痫产生。2.Me CP2Tg1小鼠癫痫易感性增高,海马区锥体神经元和抑制性中间神经元形态改变提示该小鼠癫痫的产生与兴奋-抑制失衡密切相关。