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家蚕二分浓核病毒(Bombyx mori bidensovirus,Bm BDV)是继Bm NPV(家蚕核型多角体病毒,Bombyx mori nuclear polyhydrosis virus),Bm CPV(家蚕质型多角体病毒,Bombyx mori cypovirus)之后又一种感染家蚕的特异性病毒。它是一种慢性病毒,感病家蚕7到12天死亡,其病症与浓核病毒感染相似。该病毒最初被命名为家蚕浓核病毒Ⅱ型,鉴于该病毒特异的基因组结构以及基因组中编码DNA聚合酶基因,2012年,国际病毒分类委员会新设立二分DNA病毒科,家蚕二分浓核病毒是该病毒科中的唯一代表种。Bm BDV基因组可以表达多个非结构蛋白,其中NS1蛋白由Bm BDV VD1基因组中ORF2阅读框编码,其长度为951nts(核苷酸,nucleotides),含有316个氨基酸理论序列,分子量为36 k Da,等电点为8.7。前期研究结果表明:NS1是一种多功能蛋白,不仅具有ATPase与解旋酶活性,而且还能结合特定核酸序列,且磷酸化修饰能调控NS1蛋白的生物活性。在本研究中,将NS1蛋白与GST标签融合构建原核表达载体,通过改变诱导表达条件和优化翻译起始区密码子,在大肠杆菌大量表达可溶性NS1蛋白,进而研究纯化的NS1蛋白对家蚕细胞和家蚕个体的毒性作用。另外,用pull-down实验对NS1蛋白与DNA聚合酶及家蚕丝氨酸蛋白酶Bm-SP142之间的相互作用进行分析。研究结果表明:在不同温度的诱导条件下,20℃诱导,可溶性的NS1蛋白表达量最高;而在ns1翻译起始区(translational initiation region,TIR)引入4个同义突变,未见显著提高其原核表达量;纯化的NS1蛋白添加到Bm N细胞培养基中,能明显抑制细胞增长,Bm N细胞形态发生改变;NS1蛋白注射到家蚕血液中,会加速家蚕死亡。本研究为解析NS1蛋白的分子机制具有一定作用。具体研究内容如下:(1)NS1原核表达载体构建,通过一系列PCR、酶切与酶连,构建了NS1蛋白与GST标签融合的原核表达质粒p GEX-5X-3-ns1 wt。其次,为了提高NS1蛋白在大肠杆菌表达量,在ns1基因的翻译起始区TIR区中引入4个翻译频率较高的同义突变,构建了GST标签融合的重组质粒p GEX-5X-3-ns1 M。另外,构建了NS1蛋白与His标签融合的重组质粒p ET30a-ns1 C。(2)2种重组质粒在大肠杆菌BL21中的表达,用4种不同温度(16℃、20℃、28℃、37℃)诱导重组质粒表达,在20℃时,p GEX-5X-3-ns1 wt可溶性NS1蛋白表达产量最高;在20℃和37℃两种温度诱导条件下,比较野生型重组质粒p GEX-5X-3-ns1 wt和TIR的突变型重组质粒p GEX-5X-3-ns1 M表达NS1蛋白,结果显示NS1翻译起始区的密码子同义突变并不能明显提高目的蛋白的表达量与可溶性。此外,对20℃诱导表达的目的蛋白进行纯化,经质谱分析表达产物是融合蛋白NS1。(3)NS1蛋白的毒性研究,在Bm N细胞培养基中添加了不同浓度的NS1蛋白,观察NS1蛋白对家蚕培养细胞的作用。另外,用纯化NS1蛋白溶液给家蚕幼虫添食或皮下注射;观察NS1蛋白对家蚕个体的影响。结果表明:NS1蛋白能抑制Bm N细胞的正常生长与增殖。添食NS1蛋白对家蚕没有毒性,而皮下注射NS1蛋白会致家蚕死亡;(4)NS1的互作蛋白研究,前研究结果报道:NS1蛋白能与家蚕丝氨酸蛋白酶Bm-SP142和病毒VD1-ORF4编码的DNA聚合酶结合。为深入研究NS1蛋白与这两种蛋白哪个区域结合,本论文通过体外pull-down实验,将NS1蛋白与Bm-SP142蛋白、VD1-ORF4截短的3个原核表达产物互作分别进行了分析,结果都呈阴性,表明NS1蛋白与这些蛋白的相互作用较弱,或许它们结合还需要其它蛋白的介入等其它因素。