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真菌免疫调节蛋白(fungal immunomodulatory protein,FIP)是在食用和药用蕈菌子实体中含有的一类具有生物活性功能的小分子蛋白质,它们的结构功能与免疫球蛋白超家族具有很大的相似性,并具有抗肿瘤、抗过敏、刺激免疫细胞产生多种细胞因子的免疫调节作用,拥有良好的临床应用前景和药用保健价值。本研究主要以来源于赤灵芝(Ganoderma lucidum)的FIP-glu以及来源于赤灵芝和紫芝(G.sinensis)FIP基因重组得到的FIP-SN15为材料,探索FIPs在酿酒酵母中的表达,以期为利用酿酒酵母表达系统生产FIPs提供理论依据.本试验利用酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)INVSc1菌株和配套载体pYES2/NT b表达了重组FIP-glu(recombinant FIP-glu,rFIP-glu)和重组FIP-SN15(recombinant FIP-SN15,rFIP-SN15)两种真菌免疫调节蛋白。首先构建表达载体pYES2-FIP-glu和pYES2-FIP-SN15,随后将构建好的载体转化酿酒酵母INVSc1。利用SD/Ura-诱导培养基筛选和PCR技术鉴定酿酒酵母阳性转化子。转化子经过半乳糖诱导,收集诱导后的酵母菌体并破碎,提取酵母的胞内蛋白,然后用钴离子树脂纯化柱纯化得到rFIP-glu和rFIP-SN15蛋白,通过蛋白浓度测定结果计算rFIP-glu和rFIP-SN15蛋白的表达量分别为1.27 mg/L和1.51mg/L。将得到的纯化蛋白用于SDS-PAGE和Western blot检测分析,发现成功得到了两种蛋白且存在糖基化现象。最后利用rFIPs处理小鼠脾细胞,处理组蛋白浓度分别为1、2和4μg/mL,通过荧光定量PCR方法检测各处理组小鼠脾细胞干扰素-γ(interferon-γ,IFN-γ)和白介素-2(interleukin-2,IL-2)的基因表达量与对照组之间的差异。结果表明,在一定的浓度范围内(1–4μg/mL),rFIP-glu和rFIP-SN15均能提高小鼠脾细胞IFN-γ和IL-2的表达量,但是两种蛋白存在一定的差异,例如rFIP-glu对提高IL-2的表达量作用更大,而rFIP-SN15则对提高IFN-γ的表达量作用更大。由于rFIP-glu和rFIP-SN15表达量较低,本研究尝试通过从培养条件和培养基的组成成分两方面改良诱导条件,其中培养条件我们选择调整培养基的初始pH值,培养基的组成成分我们选择调整碳源(半乳糖)和氮源的浓度,以期提高酿酒酵母转化子的真菌免疫调节蛋白产量。在经过三个单因素试验分别筛选了上述三个因素最优的三个水平之后,用L9(33)安排三因素三水平正交试验,对实验数据处理之后,得到最佳诱导条件是培养基初始pH 5.5,半乳糖浓度20 g/L,氮源浓度9.0 g/L。总之,灵芝FIPs能够在酿酒酵母中成功表达,意味着利用基因工程手段可以方便快捷地获得大量的rFIP蛋白,重组蛋白与从天然高等真菌体内分离纯化得到的蛋白既有相似的结构,又有相近的生物学功能。rFIP-glu和rFIP-SN15在酿酒酵母中的成功表达能为进一步探索真菌免疫调节蛋白的生物学功能和其在医药领域的应用奠定基础。