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目的 探讨卷柏总黄酮(Total Flavonoids of Selaginella Tamariscina,TFST)及穗花杉双黄酮(Amentoflavone,AMT)对损伤的血管内皮细胞的保护作用及其作用机制,并比较二者对血管内皮保护作用的强弱。
方法 1.选择体外培养的人脐静脉内皮细胞(human umbilical vascular endothelial cell,HUVEC)为研究对象,建立肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor-alpha,TNF-α)诱导HUVEC细胞复制血管内皮细胞(vascular endothelial cell,VEC)损伤模型。
2.MTT法确定TFST和AMT作用于HUVEC细胞的量效、时效,并检测TFST和AMT对HUVEC细胞增殖的影响,同时采用流式细胞术检测TFST和AMT对HUVEC细胞周期的影响来探讨增殖机制。
3.在诱导模型及药物作用量效、时效都已确定的基础上,采用MTT法检测TFST和AMT对TNF-α诱导HUVEC细胞增殖的影响,通过硝酸还原酶法检测NO及酶联免疫吸附实验(ELISA)检测ET-1来探讨TFST和AMT对内皮的保护作用；检测超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)来探讨药物的抗氧化作用。
4.通过ELISA法检测炎症相关因子与氧化损伤相关因子并作相关性分析；采用ELISA法和免疫印迹法(Western-blotting)检测粘附因子VCAM-1、E-selectin,炎症因子IL-6、IL-8蛋白的表达来探讨TFST和AMT对血管内皮炎症损伤的保护作用。
5.通过Western-blotting法检测IκBα、胞核NF-κBp65蛋白表达以及采用激发光共聚焦显微镜技术检测NF-κBp65的核迁移情况来探讨TFST和AMT对NF-κB信号通路的影响。
6.采用上述所有方法,检测TFST和AMT对血管内皮损伤的保护作用。
结果 1.经查阅文献TNF-α作用的最佳剂量为10 ng·mL-1,ELISA法检测VCAM-1、E-selectin结果显示：TNF-α作用的最佳作用时间是24h(p<0.01)。
2.MTT 实验结果显示：TFST 的最佳作用时间是 36h,有效剂量是 5μg·mL-1、10μg·mL-1、15μg·mL-1、20μg·mL-1；AMT的最佳作用时间是12h,有效剂量为2μg·mL-1、4μg·mL-1、6μg·mL-1、8μg·mL-1(p<0.01)。对HUVEC细胞增殖结果显示：与正常组相比较,TFST 浓度为 5μg·mL-1、10μg·mL-1、15μg·mL-1、20μg·mL-1 及 AMT 浓度为2μg·mL-1、4μg·mL-1、6μg·mL-1、8μg·mL-1时细胞存活率极显著性增高(p<0.01)。流式细胞术结果显示：与正常组相比,TFST 浓度为 5μg·mL-1、10μg·mL-1、15μg·mL-1、20μg·mL-1及AMT浓度为2μg·mL-1、4μg·mL-1、6μg·mL-1、8μg·mL-1使S期细胞百分比显著性增加(p<0.01)。
3.对TNF-α诱导HUVEC细胞增殖结果显示：与正常组相比,模型组细胞存活率(%)明显降低；与模型组相比较,TFST及AMT不同浓度时细胞存活率(%)明显增高(p<0.01)。检测NO和ET-1结果显示：与正常组相比,模型组NO含量显著性降低, ET-1 的含量显著性升高(p<0.01)；与模型组相比,卷柏总黄酮和穗花杉双黄酮各剂量组均可使NO含量显著性升高,ET-1含量显著性降低(p<0.01)。SOD和MDA结果显示：与正常组相比,模型组 SOD 显著性降低,MDA 极显著性增高(p<0.01),卷柏总黄酮和穗花杉双黄酮各剂量组能显著性提高SOD活力,降低MDA水平(p<0.01)。
4.相关性分析表明：在TNF-α诱导损伤的HUVEC细胞损伤的细胞模型中,SOD与 VCAM-1、E-selectin、IL-6、IL-8 呈显著性负相关(r=-0.870,-0.97-0.990,-0.937)；MDA与VCAM-1、E-selectin、IL-6、IL-8呈显著性正相关(r=0.850,0.623,0.782,0.693)。检测炎症因子和粘附因子结果显示：与正常组相比,模型组VCAM-1、E-selectin、IL-6、IL-8 的含量显著性升高(p<0.01)；与模型组相比,卷柏总黄酮组和穗花杉双黄酮组均可使VCAM-1、E-selectin、IL-6、IL-8含量显著性降低(p<0.01)。Western-blotting结果显示：与正常组相比,模型组VCAM-1、E-selectin蛋白表达上调(p<0.01)；与模型组相比,卷柏总黄酮组和穗花杉双黄酮组均可使VCAM-1、E-selectin蛋白表达显著性的下调(p<0.01)。
5.对NF-κB信号通路结果显示：与正常组相比,模型组IκBα蛋白表达显著性下调,胞核蛋白NF-κBp65表达显著性上调(p<0.01)；与模型组相比,卷柏总黄酮和穗花杉双黄酮均可显著性的上调IκBα蛋白表达,使胞核蛋白NF-κBp65表达显著性下调(p<0.01)。CLSM结果显示：随着TFST和AMT浓度的增加,荧光由黄色到橘色,提示NF-κBp65从胞浆迁移进入胞核量的由多到少,即NF-κB的活性强度逐渐减弱。
6.TFST和AMT在最佳剂量和最佳作用时间的条件下对HUVEC保护作用进行对比研究,从检测NO/ET-1、SOD/MDA、VCAM-1、E-selectin、IL-6、IL-8蛋白的表达以及NF-κBp65的核迁移的情况的结果显示：与正常组相比,模型组NO降低、ET-1增加、SOD活力降低、MDA含量增加、VCAM-1、E-selectin、IL-6、IL-8蛋白表达上调(p<0.01),免疫荧光叠加显黄色；与模型组相比,卷柏总黄酮及穗花杉双黄酮均可显著性的增加 NO、减少 ET-1、增加 SOD 活力、降低 MDA 含量、下调 VCAM-1、E-selectin、IL-6、IL-8蛋白表达(p<0.01)、免疫荧光叠加由黄色到橘色,且卷柏总黄酮的作用强度强于穗花杉双黄酮。
结论 1. TFST和AMT对HUVEC的保护作用可能是通过上调NO分泌、下调ET-1的表达,进而改善血管内皮功能来实现的。
2. TFST和AMT对HUVEC的保护作用机制可能与①抗氧化损伤；②抑制NF-κB信号通路的激活；③抑制NF-κB信号通路调控的下游粘附因子VCAM-1、E-selectin,炎症因子IL-6、IL-8等的表达有关。
3. TFST和AMT都具有保护HUVEC的作用,从改善血管内皮功能、抗氧化损伤、抗炎症损伤、抑制NF-κB信号通路激活进行对比研究,提示TFST强于AMT。