背景:尽管目前不断有新药（比如蛋白酶体抑制剂,免疫调节剂以及CD38单抗等）用于多发性骨髓瘤（Multiple myeloma,MM）的治疗,使得MM患者的治疗效果不断提高,但该疾病目前仍是不可治愈的,患者最终会进展或复发。因此,开发新的治疗方法可能会给MM的治疗带来新的希望。微小RNA（microRNA,miRNA）是一类具有调控功能的不编码蛋白质的小RNA,它们在MM发病过程中的重要作用已被证实。我们的前期研究显示:在MM细胞中,miR-15a的表达是明显下调的,且其表达的下调和不良预后相关。上调miR-15a的表达,可以抑制肿瘤增殖,促进肿瘤凋亡。由此可以看出:miR-15a在MM细胞中发挥抑制肿瘤的作用,所以,上调miR-15a的表达以发挥其抑制MM的功能,很有可能成为治疗MM的一种新方法。然而,目前尚无特效药物直接靶向上调某个miRNA的表达。目前常用的方法为设计特定miRNA的类似物,然后通过外源性补充该类似物,来发挥其调控功能或治疗功能。目前,miRNA的类似物都是设计成双链小分子RNA结构。这种小分子,可以很好的模拟miRNA,但是其自身也存在一些难以克服的缺陷:比如不够稳定,在生物体内半衰期短等。所以我们需要在双链小分子RNA之外,探索新的,更有优势的miRNA的类似物。目的和意义:本研究创新性的尝试寡单链DNA,作为miRNA的类似物,并验证其功能。我们首先根据hsa-miR-15a-5p序列,设计了寡单链DNA,将其作为hsa-miR-15a-5p的类似物。然后通过体外以及体内研究验证它是否能模拟miR-15a的功能、是否具有抗MM作用。本研究的最大意义在于:为miRNA的类似物,提供了一种全新的选择。而且,从分子结构及稳定性上对比,寡单链DNA比双链小分子RNA更有优势。寡单链DNA分子更小,所带负电荷更少,其亲脂性基团没有被包在分子内部,所以更容易进入细胞,发挥药理作用。另外,寡单链DNA稳定性更好,更利于药物的存储和运输,也使药物在生物体内有更好的生物利用度。虽然天然状态的寡单链DNA在全身应用以后,容易被循环系统及细胞内的核酸酶降解,也容易经肾脏快速排泄,但是寡单链DNA经过锁核酸（Locked nucleic acid,LNA）修饰以后,这一缺陷被很好的纠正。方法:本研究共设计了2种形式的寡单链DNA作为miR-15a的类似物。一种是未经修饰的天然状态的寡单链DNA称之为OMM-15a;OMM-15a的两端经过LNA并且其中的磷酸经过硫代修饰后,称之为LNA-15a。1、细胞试验:OMM-15a和LNA-15a均借助脂质体3000转染骨髓瘤细胞系ARP1、OCI-My5及乳腺癌细胞系MCF7,OMM-15a和LNA-15a转染浓度均为25 nM,然后分别在转染后24 h、48 h和72 h收集细胞。细胞收集后,用台盼蓝染色及细胞计数的方法,测定细胞增殖及活力;用流式细胞术检测细胞凋亡比例。另外,将转染后不同时间点的细胞,经裂解提取总RNA及蛋白,然后用实时荧光定量聚合酶链式反应（Quantitative real-time polymerase chain reaction,q RT-PCR）及Western Blot的方法从mRNA及蛋白水平检测miR-15a的靶基因的表达。2、LNA-15a和硼替佐米（Bortezomib,BTZ）的协同作用:ARP1和OCI-My5细胞在使用BTZ 10 nM处理的基础上,对比转染LNA-15a和空白转染组,细胞凋亡的变化。细胞转染用脂质体lipo3000,转染浓度分别为0nM、25 nM、50 nM和100 nM。转染后的细胞在培养24 h后,收集细胞,用流式细胞术检测细胞凋亡比例,并用空白组做阴性对照。然后用Compusyn软件验证两者是否存在协同作用。3、体内试验:先用携带EX-h LUC-Lv201质粒的慢病毒颗粒转染ARP1细胞系,建立ARP1-GFP+-Luc+细胞稳定转染细胞株。将稳定转染后的ARP1细胞,在7周龄雌性NOD/SCID小鼠右侧进行皮下成瘤,每只小鼠皮下注射1×10~6个细胞。小鼠成瘤1周后,随机分为3组,分别皮下注射PBS、OMM-15a和LNA-15a,用法均为每周一次。每只小鼠每次的用量为:PBS100μL/次,每周一次;OMM-15a和LNA-15a均为10 mg/kg/次,每周1次,均采用皮下注射的方法给药,共注射3次。体内实验共进行2次,第1次是在给药1周后,每周进行1次活体成像,共做3次活体成像,末次活体成像后处死小鼠,并分离小鼠瘤组织。测量瘤组织大小,并通过q RT-PCR和Western blot的方法,验证miR-15a靶基因的表达水平。第2次体内实验则是在肿瘤可以触及开始,用游标卡尺隔日测量肿瘤大小,并在肿瘤体积大于等于1500mm~3时处死小鼠,然后对各组小鼠做生存分析。结果:1、先用LNA-15a转染ARP1、OCI-My5和MCF7,分别在转染24 h、48 h和72 h后,检测细胞的增殖、细胞的活力以及细胞的凋亡。结果显示:和空白对照组相比,细胞的增殖以及细胞的活力在这3个细胞系,均明显下降,而且细胞的凋亡在这3个细胞系,均明显的增加。增加LNA-15a的转染浓度后,对肿瘤细胞增殖或活力的抑制也随之增加,不同的细胞系表现不同。然而,OMM-15a在转染ARP1、OCI-My5及MCF7后,和空白对照组相比,细胞的增殖、细胞的活力以及细胞的凋亡,均没有明显差异,即使增加OMM-15a的转染浓度,差异也不明显。2、先用LAN-15a转染ARP1、OCI-My5及MCF7,分别在转染24 h、48 h和72 h后,通过q RT-PCR和Western blot检测miR-15a靶基因的mRNA及蛋白的表达水平。结果显示:在这3个细胞系中miR-15a靶基因的表达,不论是在mRNA水平还是在蛋白水平,均在LNA-15a转染后明显下降。而OMM-15a转染骨髓瘤细胞系ARP1、OCI-My5及MCF7后,miR-15a的靶基因,在mRNA水平,仅有部分基因的表达降低;在蛋白水平,miR-15a的靶基因仅有PHF19在ARP1细胞系被转染后的24 h表达下降,其他基因以及PHF19在其他细胞系的表达均没有明显下降。3、骨髓瘤细胞系ARP1和OCI-My5在予以BTZ处理的同时转染LNA-15或转染空白对照试剂。和转染空白对照试剂的细胞相比,转染LNA-15a的细胞凋亡明显增加,提示LNA-15a可以增加BTZ的抗肿瘤活性。而且,在OCI-My5细胞系,细胞的凋亡,还随着LNA-15a转染浓度的增加而增加,经Compusyn软件进行协同分析,显示LNA-15a和BTZ之间具有协同作用。4、NOD/SCID小鼠,在用ARP1-GFP+-Luc+细胞系皮下成瘤以后,随机分为3组:PBS组,OMM-15a组以及LNA-15a组,并按要求给药。先后通过活体成像以及游标卡尺测量的方式,检测肿瘤负荷的变化。经过治疗后,LNA-15a组小鼠的肿瘤负荷和PBS组小鼠相比,明显变小。不仅如此,小鼠的生存也明显延长。而OMM-15a组小鼠的肿瘤负荷以及生存和PBS组相比,均没有明显差异。进一步,我们通过q RT-PCR和Western blot进行验证显示:LNA-15a治疗组小鼠肿瘤细胞中,miR-15a的靶基因的表达,不论是在mRNA水平还是在蛋白水平,和PBS组相比,均明显受抑制。而OMM-15a治疗组小鼠肿瘤细胞中,miR-15a的靶基因的表达,不论是在mRNA水平还是在蛋白水平,和PBS组相比,整体差异不大。结论:1、LNA-15a具有明显的抗肿瘤活性,可以明显抑制骨髓瘤细胞系ARP1、OCI-My5及乳腺癌细胞系MCF7的增殖,也可以明显促进它们的细胞凋亡。2、OMM-15a没有明显的抗肿瘤活性,不能抑制肿瘤细胞的增殖,也不能促进它们的凋亡。3、LNA-15a在细胞内可以很好的模拟miR-15a的功能。它对miR-15a的靶基因,不论是在在mRNA水平,还是在蛋白水平,均有明显的抑制作用。4、LNA-15a可以增强BTZ的抗MM作用,而且在OCI-My5细胞系,LNA-15a和BTZ显示出明显的协同作用5、LNA-15a在小鼠体内也有明显的抗肿瘤作用,不仅明显抑制肿瘤的生长,还能延长小鼠的生存。而且,在小鼠体内,也能较好的模拟miR-15a的功能,抑制其靶基因的表达。