植物细胞质雄性不育(cytoplasmic male sterility, CMS)不仅在杂交制种中具有重要的应用价值,而且还是研究核质互作的重要材料。玉米C型不育系由于具有抗病,花粉败育较彻底等优点,被认为是用于生产玉米杂交种的最具潜力的细胞质雄性不育类型之一。但关于玉米C型细胞质雄性不育的发生机制及育性恢复机理的研究一直未取得突破性进展。1991年,Dewey等发现玉米C组不育胞质的线粒体中存在特异嵌合基因,它们分别为atp6-c、atp9-c和cox2-c。atp9-c的5’端非编码区插入了一段约为199bp与T胞质中nad4L同源序列。cox2-c由5’端非编码区插入了约为550bp与atp6基因编码区同源的序列。atp6-c嵌合基因由来源于atp9基因的5’端区段约36bp、未知来源的441个碱基的阅读框和atp6基因保守区域约800bp三部分组成。即atp6-c缺少正常atp6基因5’端424bp区域。虽然这3个嵌合基因已经发现了20多年,但直接导致CMS-C败育的基因仍不清楚。本研究将以C型胞质中特有嵌合基因atp9-c、atp6-c、cox2-c作为候选基因,以同核异质、同质异核C型不育系C48-2、C黄早四,保持系48-2、黄早四和育性恢复F1(C黄早四xMo17)、F1组合(C黄早四×自330)、F1组合(C48-2×18-599白)、F1组合(C48-2×Mo17)为材料,提取单核期花药线粒体DNA和小孢子不同发育时期的线粒体RNA,从转录及转录后水平对候选基因进行表达分析。主要研究结果如下：1.利用荧光定量qRT-PCR方法,分析C胞质和正常胞质线粒体基因(atp6, atp9, cox2基因保守序列)及C胞质特有基因atp6-c, atp9-c, cox2-c的表达情况,结果显示线粒体基因atp9、cox2和atp6在不育系小孢子发育的四分体时期几乎都高表达,而到单核期表达量明显降低。这可能与C胞质的败育在单核期发生有关。除此以外,研究还发现在小孢子发育的过程中特别是单核期,atp6-c在不育系中的表达均高于育性恢复Fl,并且差异均在两倍以上。说明本研究中所用的父本测验系可以使atp6-c基因表达量降低,这可能是C型胞质育性恢复的原因之一。2.根据已知的玉米正常胞质中atp6-n基因和C胞质中atp6-c基因序列设计引物,在不育系C黄早四、C48-2和保持系黄早四、48-2的线粒体DNA和cDNA中进行扩增,结果显示根据atp6-c基因设计的引物在C型不育系线粒体DNA和cDNA中都能扩增出目的条带,但在保持系中没有扩增。根据线粒体atp6-n基因设计的引物在保持系的线粒体DNA和cDNA中均能扩增出目的条带。在C型不育系的线粒体DNA中不能扩增出条带,而在cDNA中却能扩增出与目的片段大小一致的条带。测序结果显示,在C型不育系线粒体cDNA中得到的片段与atp6-n基因序列同源性高达99%以上,因此将该片段称为atp6-n’。除此以外,研究还发现atp6-n’不仅在C型不育系中表达,在可育F1中也表达。这种在DNA上不存在但在RNA水平上能检测到的转录本被称为融合转录本。分析这个新的融合转录本atp6-n’的序列特征,发现在C胞质的线粒体DNA中存在与它部分同源的序列,融合转录本的前550bp与C胞质中cox2基因5’端-558至-8bp区域相同,它的后800bp与C胞质中atp6-c基因+480至+1280bp区段同源。这两段序列之间相隔甚远,而且其间还穿插了多个其它基因,如cox2基因。因此,推测atp6-n’很可能是通过反式剪接形成。其中cox2基因5’端-558至-8bp区段可能为atp6-n’的供体所在区域,atp6-c基因+480至+1280bp区段可能为受体所在区域。并且供体cox2基因5’端-135至-8bp区段与受体atp6-c基因+480至+607bp区段高度同源,只存在两个碱基的差异,将这两个差异碱基位点命名为a,b。因此,供体剪切位点和受体剪切位点很可能在这127bp内。3.在对融合转录本atp6-n’克隆测序的过程中,发现其存在RNA编辑现象。为探明融合转录本atp6-n’的形成过程与RNA编辑的关系及它们与育性变化的联系,本实验以直接测序的方式分析atp6-n和atp6-c基因共有的保守区域(约800bp)、atp6-n基因+385至+1224bp区段(保守区域向5’端延伸40bp左右)、atp6-c基因+445至+1280bp区段(保守区域向5’端延伸40bp左右)和cox2基因5’端-135至-8bp区段,共四个部分的RNA编辑情况。由于atp6-n和atp6-c基因共有的保守区域只存在两个碱基的差异而被称为atp6基因的保守区域。在所有供试材料中,atp6-n和atp6-c基因共有的800bp区域内均存在18个相同的编辑位点,其中有12发生在第二位点上,4个在第一位点上,2个在第三位点,在最后一个编辑位点引入了一个终止密码。编辑方式均为C-U的转换。除此以外,在atp6-n基因+385至+1224bp区域内还检测到两个新的C胞质特有的编辑位点。这两个新的编辑位点只存在于不育系及可育F1中,在保持系中未发生编辑。并且这两个编辑位点正好与融合转录本atp6-n’的供体和受体区域存在差异的碱基a,b位点相同,这也正是atp6-n与atp6-c基因保守区域存在差异的地方。位点a,b在atp6-n基因中为CA,在atp6-c基因中为TG。而融合转录本atp6-n’中这两个位点a,b正好存在T-C, G-A转换。这表明在C胞质中存在与atp6-n基因完全相同的转录本。其中a位点的编辑没有引起氨基酸的变化,但b位点的编辑使带负电荷的谷氨酸变为带正电荷的赖氨酸。经SWISS-MODEL预测,这个氨基酸的变化会引起蛋白质空间结构的较大改变。a,b两个编辑位点的编辑频率在四分体和单核时期(小孢子败育时期)都表现为可育F1高于不育系。特别是在单核时期,可育F1(C48-2×18-599白)中a,b编辑位点的编辑频率比不育系C48-2的分别高出了31%和27%。可育F1(C黄xMo17)中a,b编辑位点的编辑频率也比不育系C黄早四的均高出25%左在。编辑频率的变化会直接影响到转录本概率的变化,即两个新的编辑位点的编辑频率高低可以反应出atp6-n基因在C胞质中的表达情况。在可育F1中这两个新的编辑位点的编辑频率高,反应出atp6-n基因在可育F1中表达量可能相对不育系较高。这些变化可能与C型胞质育性恢复有关。在融合转录本atp6-n’的形成过程中,cox2基因5’端-135bp至-8bp区段可能作为atp6-n’的供体所在区域,但其a,b位点未发生编辑。该区域只有一个编辑位点与atp6-n和atp6-c基因共有的18个编辑位点的第一个位点相同,但是该位点的编辑频率明显低于其它区域,这很可能与反式剪接过程有关。综上所述,在融合转录本的供体和受体中a,b位点均没有发生编辑,在供体中a,b位点为C,A,而在受体中a,b位点为T,G。说明融合转录本中这两个新的编辑位点a,b可能是在反式剪接过程中产生。4.分别构建atp6-c基因的原核表达载体pET-28a-atp6-c, pGEX-6p-atp6-c。将构建好的载体分别转化大肠杆菌Resseta(DE3)后利用IPTG诱导分析其表达产物对细菌生长的影响。结果发现pET-28a-atp6-c重组子诱导表达的非融合蛋白抑制了大肠杆菌的生长,但用SDS-PAGE无法检测到,说明产生的蛋白质很少。而pGEX-6p-atp6-c重组子诱导表达的含有GST标签ATP6-C融合蛋白对细菌的生长影响却并不明显。说明天然的ATP6-C蛋白可能是一种毒性蛋白。综上所述,本研究在C型不育系中,检测到atp6-n基因完整的转录本。atp6-c基因编码的蛋白不仅具有的跨膜结构,而且与正常ATP6-N蛋白具有很高的相似性,因此ATP6-C蛋白可能干扰正常ATP6-N蛋白的功能。通过原核表达分析显示atp6-c基因编码的蛋白ATP6-C对大肠杆菌的生长有抑制作用,很可能为一个毒性蛋白,该蛋白有可能是通过影响线粒体膜的通透性而导致花药败育。相应地,育性恢复的F1中含有的育性恢复相关基因通过提高C胞质特有的RNA编辑位点的编辑频率使反式剪接产生的正常atp6-n基因的表达量增加,从而为花粉的正常发育提供更多的能量。正常atp6-n基因的表达量的增加需要消耗更多的受体(atp6-c基因后面800bp区域),这就导致完整的atp6-c基因的转录本在育性恢复F1中减少。ATP6-C对正常ATP6-N蛋白的干扰可能减小对线粒体的毒害作用也可能减轻,从而使C型胞质的育性恢复。