龋病是危害人类口腔健康的常见病,变异链球菌(简称变链菌)是公认的主要致龋菌,对其研究目前已深入到分子水平。但是,长期以来的绝大多数研究是以悬浮于培养基中的浮游状态细胞作为研究对象,而在自然条件下,变链菌在口腔中是以牙菌斑这一典型的生物膜结构形式存在。牙齿萌出到口腔后,变链菌即在牙面黏附和聚集,最终形成复杂的生物膜结构以适应不断变化的口腔环境,并在条件合适时致龋。因此,研究变链菌生物膜的致龋特性对于进一步阐明龋病发病机制、疾病风险性评估以及生态防治均有重要意义。同时,随着科学技术的发展和激光共聚焦扫描显微镜的问世,近来实时、完整、动态地观察生物膜已成为可能。另一方面,随着对变链菌致龋生物学性能的广泛、深入研究,学者们发现在致龋过程中变链菌的数量并不是唯一的决定因素,其菌株间存在的致龋能力差异也是重要的影响因素,因此,了解变链菌临床株间致龋能力的差异将有助于提高龋病风险性预测的准确性。为研究变链菌菌株间致龋性的差异及其原因,本课题组前期已分别自高龋患者和无龋健康人口内分离获得血清C型变链菌593号临床株和18号临床株,两菌株不仅在体内表现出致龋差异,通过基因型分析、系列体外致龋实验和蛋白组学研究发现,其基因型、体外致龋能力和功能蛋白表达均存在差异。在此基础上,本研究利用激光共聚焦扫描显微镜和荧光染色技术,以及扫描电镜对变链菌标准株ATCC 25175、593号临床株和18号临床株的生物膜分别进行定性、定位和定量的比较研究。本研究包括四部分实验:实验一变异链球菌生物膜形成能力差异研究目的:了解变链菌标准株ATCC 25175、593号临床株和18号临床株各自体外生物膜的连续动态形成演替过程及其差异。方法:在聚苯乙烯塑料片上分别形成0.5,1,1.5,2,4,6,12,16,18,20,72小时变链菌生物膜标本,应用激光共聚焦扫描显微镜及死菌和活菌荧光染色技术相结合的方法,对各时间段的菌斑生物膜进行原位、实时观察,通过对断层扫描图像的重建得到生物膜的三维图像,测量生物膜厚度,计算生物膜中细菌密度和活菌百分比。结果:各菌株在聚苯乙烯塑料片表面均可黏附形成具有空间立体结构,形态多样的致密生物膜,其主要由非均质分布的死细菌和活细菌组成,且同菌株不同层面以及不同时间段生物膜的细菌密度和死菌活菌比均不同。不同菌株同时间段形成的生物膜厚度、细菌密度、活菌百分比也存在差异。结论:变链菌生物膜是由大量微菌落组成,具一定厚度、形态结构复杂多样、不均质的三维结构。593号临床株的生物膜形成能力强于18号临床株和标准株ATCC 25175,18号临床株和标准株ATCC 25175间差异无显著意义。实验二变异链球菌生物膜状态黏附能力差异研究目的:了解变链菌标准株ATCC 25175、593号临床株和18号临床株在体外黏附、聚集形成生物膜的过程及其表面形态和差异。方法:在聚苯乙烯塑料片上分别形成2,3,4,6,12,20小时变链菌生物膜标本,用扫描电镜观察各时间段生物膜标本的表面形态和变链菌黏附情况。结果:各时间段变链菌不同菌株对聚苯乙烯塑料片的黏附能力不同,其形成的生物膜表面形态也存在差异。结论:593号临床株的黏附能力强于18号临床株和标准株ATCC 25175,18号临床株和标准株ATCC 25175间未见明显差异。实验三变异链球菌生物膜耐酸能力差异研究目的:了解变链菌标准株ATCC 25175、593号临床株和18号临床株生物膜的耐酸能力及其差异。方法:(1)首先在聚苯乙烯塑料片上分别形成幼龄生物膜(3小时)、成熟生物膜(20小时)标本,然后将不同时间段形成的生物膜标本随机分成预酸化组和非预酸化组。预酸化组先将生物膜标本置于pH5.5的TPY液体培养基中预酸化3小时,然后再将之置于pH3.0的TPY液体培养基中强酸化30min;非预酸化组则直接将生物膜标本置于pH3.0的TPY液体培养基中强酸化30min。酸化后的标本采用荧光染色技术分别对死菌和活菌进行染色,然后通过激光共聚焦扫描显微镜观察;(2)在聚苯乙烯塑料片上形成20小时变链菌生物膜标本,然后将之随机分成饥饿组和非饥饿组。饥饿组置于PBS液缓冲液中(无营养培养),非饥饿组置于TPY液体培养基中,厌氧培养24小时后取出生物膜标本,再置于pH3.0的TPY液体培养基中强酸化30min,然后同上法观察生物膜标本。结果:(1)经过预酸化处理的幼龄生物膜(3小时)、成熟生物膜(20小时)标本经强酸化后的活菌比例均较非预酸化组增高,其中593号临床株生物膜的活菌比例显著高于其他菌株。(2)无论是否经过预酸化处理,幼龄生物膜(3小时)标本酸化后活菌数量下降较成熟生物膜(20小时)标本酸化后活菌数量下降更为显著,其中593号临床株生物膜活菌数量下降较其他菌株为少。(3)饥饿生物膜酸化后活菌比例显著高于非饥饿生物膜,其中593号临床株的活菌比例显著高于其他菌株。结论:变链菌生物膜经过预酸化可具有更强的耐酸能力;幼龄生物膜(3小时)的耐酸能力较成熟生物膜(20小时)弱;饥饿可增加变链菌生物膜的耐酸能力;各状态下593号临床株生物膜的耐酸能力均强于18号临床株和标准株ATCC 25175,18号临床株和标准株ATCC 25175间差异无显著意义。实验四变异链球菌生物膜合成胞外多糖能力差异研究目的:了解变链菌标准株ATCC 25175、593号临床株和18号临床株生物膜不同时间段合成胞外多糖的变化情况及其差异。方法:(1)在聚苯乙烯塑料片上分别形成3,12,20小时变链菌生物膜标本,用荧光染料FITC-ConA对胞外多糖进行染色,激光共聚焦扫描显微镜观察。(2)将变链菌分别进行静置培养,以得到生物膜状态生长的变链菌,蒽酮法测量生物膜状态下不同时间段变链菌合成胞外多糖能力的差异。结果:同菌株不同时间段生物膜胞外多糖的分泌量和分布不同,同时不同菌株间也存在差异。结论:生物膜形成过程的不同阶段其合成胞外多糖的能力不同;相同条件下,593号临床株生物膜合成胞外多糖的能力强于18号临床株和标准株ATCC 25175,18号临床株和标准株ATCC 25175间差异无显著意义。综上所述,593号临床株的生物膜形成能力以及生物膜状态黏附能力、耐酸能力、合成胞外多糖能力均强于18号临床株和标准株ATCC 25175。而593号临床株在与致龋力密切相关的四个方面均表现出的更强能力,这可能也就是593号临床株在临床上表现出高致龋性能的部分原因。