乳腺癌的浸润和转移是乳腺癌治疗中面临的难题。而这一病理变化是一个多步骤、多因素参与的极其复杂的过程。细胞外基质(ECM)和基底膜的降解与破坏是这一过程中首要步骤。基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases,MMPs)家族作为一类锌离子依赖的蛋白水解酶,能够降解和重塑细胞外基质,肿瘤侵袭转移等病理过程中多有此类蛋白水解酶分泌增多和活性增强。MMPs的表达、分泌及活化受到多种细胞因子和激素等细胞外因素的调节。RECK基因是1998年发现的肿瘤抑制基因,研究表明RECK蛋白可以抑制MMP-9(还有MMP-2)分泌及其酶解活性而发挥抑制肿瘤转移的作用,所以认为是一种新的抑癌基因,近来发现RECK在多种癌中表达下调或者消失。失去了RECK的负性调控,MMPs分泌增多,活性增强,癌细胞的侵袭能力亦有增高。基因的转录和表达可以受到细胞核内染色质结构改变的调控,而染色质内基因某区段的DNA甲基化、核小体内组蛋白修饰、组蛋白与DNA结合与解离等是真核基因表达调控的重要机制。恶性肿瘤中组蛋白异常修饰是一个正在积极研究的课题,尤其是组蛋白乙酰化与去乙酰化异常的研究最多。组蛋白去乙酰化修饰由去乙酰化酶(histonedeactylase)(即HDAC)来完成,后者是一种基因转录调控因子,此酶活性增强能抑制某些抑癌基因的转录,使基因表达下调或者沉默(silencing)。我们设想RECK基因在乳腺癌中下调与去乙酰化酶的表达和活性增高有关,导致RECK基因转录受到抑制。应用去乙酰化酶抑制剂可以解除对RECK基因的转录抑制,使后者重新表达或者表达上调。因此我们实验研究设计如下:(1)RECK是抑癌基因,我们研究此基因及其下游靶点MMPs在乳腺癌及乳腺癌旁正常组织中的表达,并探讨其及与乳腺癌中其他病理因子的关系。(2)检测HDAC1,RECK乳腺良恶性组织中的表达,研究它们之间的相关性,初步探讨RECK在乳腺癌中表达下调的机制。(3)以MDA-MB-231乳腺癌细胞作为研究对象,以去乙酰化酶抑制剂MS-275作用于乳腺癌细胞株,观察上述指标的变化和对癌细胞生物学行为的影响。(4)最后,在裸鼠体内实验中,研究去乙酰化酶抑制剂的抗乳腺癌效果及对RECK表达的影响,以证明组蛋白去乙酰化在RECK的下调中扮演一定的角色。第一章RECK与MMP-9在乳腺癌中表达研究目的:在mRNA和蛋白水平研究抑癌基因RECK及其下游靶点MMPs在乳腺癌及乳腺癌旁正常组织中的表达,及与其他病理因子的关系方法抽取组织总RNA,采用半定量逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测39例乳腺癌病人的癌和癌旁正常组织中RECK-mRNA和MMP9-mRNA的表达,分析其关系;另外提取组织总蛋白,应用western—blot半定量检测RECK蛋白及其靶蛋白:基质金属蛋白酶-9在乳腺癌和乳腺癌旁正常组织中的表达。结果乳腺癌癌组织RECK mRNA(表达率为32/39)(与内参比值)为0.625±0.199,较癌旁正常乳腺组织组织(表达率39/39)的0.778±0.278明显降低(P＜0.05),MMP-9 mRNA在癌和癌旁正常组织均表达,癌中为1.342±0.168,比癌旁正常组织的0.790±0.157明显升高,P＜0.01。乳腺癌组织中RECK蛋白表达(表达率为28/39)低于良性组织。表达量(经β-actin蛋白内参照平衡)在癌组织是:0.247±0.092,在癌旁正常组织(表达率为39/39),平均表达水平是0.914±0.126,P＜0.01。而MMP-9蛋白(表达率为39/39)则相反,在癌组织中表达高于良性组织,分别是:1.642±0.217和0.892±0.184,P＜0.01结论RECK作为一种抑癌基因,在乳腺癌中转录和表达显著降低。其与MMP-9存在一定的调控关系,可抑制MMP-9的表达或者活性,RECK基因可能成为抑制乳腺癌转移侵袭的新的治疗靶点。第二章乳腺癌中HDAC1和RECK的表达关系研究目的:研究(去乙酰化酶1)HDAC1-mRNA和蛋白与RECK基因及蛋白在乳腺癌中表达的状况及二者的关系。方法抽取组织总RNA,采用半定量逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测39例乳腺癌和相应癌旁正常组织中HDAC1-mRNA,RECK-mRNA。分析两者之间的关系。取新鲜组织(手术离体2小时内)以甲醛固定,石蜡包埋,切片。用免疫组化检测39例乳腺癌和相应癌旁正常组织中HDAC1蛋白的表达,研究其在乳腺癌和癌旁正常组织中的分布以及表达差异。并探讨此蛋白和乳腺癌其他病理因子之间的关系及意义。结果乳腺癌组织HDAC1-mRNA(与内参比值)平均水平为1.061±0.406。较癌旁正常组织的0.820±0.119明显升高(P＜0.05),乳腺癌癌组织RECK mRNA(与内参比值)为0.625±0.199,较癌旁正常乳腺组织组织的0.778±0.278明显降低(P＜0.05)。HDAC1和RECK两者间表达呈现负相关,相关系数r=-0.39。免疫组化染色结果显示:HDAC1主要分布在细胞胞核,HDAC1蛋白在乳腺癌组织中的表达率为100%(39/39),且多为强表达(+～+++);在癌旁正常组织中的表达率为76.9%(30/39),表达多为弱阳性,(-～++);两组差异显著:P＜0.05。在39例乳腺癌组织中,我们发现HDAC1蛋白染色的强弱与患者年龄,淋巴结转移与否,雌激素受体状况,孕激素受体的状况,Cerb-b2的状况存在明显相关性,P均＜0.05。病人年龄大于50岁者乳癌组织内HDAC1蛋白染色强于年龄小于50岁者,腋窝淋巴结阴性的病人乳癌组织内HDAC1蛋白染色强于淋巴结转移阳性病人,另外,雌激素受体和/或孕激素受体阳性的病人中,HDAC1蛋白染色强于阴性病人。Cerb-b2(-)的病人HDAC1蛋白染色强于阳性的病人。结论:HDAC1作为一种基因转录调控因子,其在乳腺癌中表达明显高于乳腺良性组织。在乳腺癌中HDAC1表达与RECK存在负相关,认为其参与了抑制RECK基因转录表达的过程。但是免疫组化染色HDAC1蛋白,与乳癌的其他临床病理因子的关系提示其在乳腺癌高表达时候,内分泌治疗效果和预后良好,HDAC1在乳腺癌中表达的高低可望成为判断乳腺癌预后的一个独立指标。第三章去乙酰化酶抑制剂对RECK在乳腺癌细胞株中表达的影响目的:观察去乙酰化酶抑制剂(MS-275)对乳腺癌细胞RECK,MMP-9的影响。同时观察对癌细胞增殖和凋亡的影响。方法:以MDA-MB-231乳腺癌细胞株为研究对象,设定非药物处理组和MS-275不同的浓度梯度作用于细胞,48h后,采用半定量逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)和蛋白定量研究(Western-blot)检测RECK和MMP-9表达的变化,并得出对癌细胞的生长抑制曲线。同时采用明胶酶谱实验检测MMP-9的活性改变。流式细胞仪测细胞的周期和凋亡情况。结果:MS-275显著抑制乳腺肿瘤细胞的生长。MTT检测结果显示,MS-275对细胞的抑制率随浓度和作用时间的增加而呈明显上升趋势,与阴性对照组相比有显著性差异。对照组细胞株RECK-mRNA表达平均水平0.47±0.06;蛋白为0.32±0.04;药物处理组1umol/L的MS-275作用48小时后为0.78±0.15;蛋白为0.61±0.05。前后比较差异有显著性(P＜0.05)。对照组细胞MMP-9mRNA表达为1.52±0.24;蛋白为1.66±0.18;1umol/L的MS-275作用48小时后则为1.44±0.16;蛋白为1.53±0.12;两组间未见明显差异,P＞0.05。明胶酶谱实验显示MMP-9活性在药物处理组明显降低;去乙酰化酶抑制剂对HDAC1有明显抑制作用:对照组细胞HDAC1-mRNA表达为0.93±0.11;药物作用后为0.55±0.06;P＜0.05。流式细胞检测显示MS-275作为抗肿瘤药物,影响细胞的增殖,细胞周期停滞在G1,G2/MA期,且凋亡细胞数目增加(细胞凋亡率为37.6%)。在G1峰前出现明显的凋亡峰。且和对照组及DMSO(MS-275的溶媒)组(凋亡率为0),差异有显著性(P＜0.05。)结论:相对于非处理组及0.25uM,0.5uM等较低浓度药物组,1uM的MS-275作用48小时后,RECK表达明显上调,而HDAC1表达明显降低;MMP-9表达没有显著改变;去乙酰化酶抑制剂可以使抑癌基因RECK在乳腺癌细胞株中表达上调。据此认为乳腺癌中RECK基因的转录抑制是与去乙酰化酶-1表达升高(活性增强)有关,染色质内HAT和HDAC二者(两者平衡可以调控基因的转录)之间失去平衡,导致RECK基因转录受到抑制。经过去乙酰化酶抑制剂药物作用,RECK基因转录抑制被取消,从而表达上调,但是蛋白定量和m-RNA水平检测MMP-9分泌量均并没有明显受到抑制,明胶酶谱显示其活性受到明显抑制。MS-275可以影响细胞的增殖(周期阻滞),使乳腺癌细胞的增殖停滞在G1和G2期;促进癌细胞凋亡。第四章去乙酰化酶抑制剂对乳腺癌细胞株侵袭能力的影响目的:观察去乙酰化酶抑制剂(MS-275)对乳腺癌细胞株增殖,凋亡,侵袭能力的影响。方法:以MDA-MB-231乳腺癌细胞株为研究对象,以1.0umol/LMS-275作用于细胞48小时,侵袭小室(模拟人工基底膜)研究细胞侵袭能力的变化。结果:侵袭小室实验中,观察透膜(模拟的人工基底膜)的MDA-MB-231细胞数目:非处理的细胞数目为186.3±16.4;DMSO组为171.6±14.8;MS-275处理组48小时的细胞数目为93±9.5;MS-275处理后细胞穿透基底膜的能力较非处理组和DMSO组明显降低,差异有显著性(P＜0.05)。结论:MS-275作为抗肿瘤药物,其抑制瘤细胞的机制是多方面的,最主要的是:对RECK基因的转录抑制解除,RECK表达上调,MMP-9活性被负性调控,导致乳腺癌细胞的侵袭能力减低。可以在临床用于预防和治疗乳腺癌的转移。第五章去乙酰化酶抑制剂在荷乳腺癌细胞的裸鼠的体内试验目的:进一步观察MS-275在体内抑制乳腺癌的效果及对抑癌基因RECK基因表达的影响。方法:BALB/C(nu/nu)雌性裸鼠(SPF级)18只,将乳腺癌细胞MDA-MB-231传代,取对数期的细胞,调整浓度为1×10~7/ml,给予0.2ml细胞悬液接种于裸鼠腋下。接种的位置略往背部靠近,2×10~6/0.2ml/site。裸鼠成瘤后,设对照的非处理组:A组;于肿瘤局部给予注射DMSO(B组,药物对照组);注射MS-275组(C组,药物组);继续观察14天后,当对照组肿瘤生长到足够大(600mm~3),绘制肿瘤生长曲线,对比肿瘤抑制率;拉颈处死全部裸鼠,取肿瘤观察并测瘤重。蛋白印迹半定量和RT-PCR检测RECK,MMP-9表达变化。免疫组化检测HDAC1的染色在各组裸鼠移植瘤内的变化。结果:人乳腺癌裸鼠皮下移植瘤模型的成功建立。裸鼠皮下接种人乳腺癌细胞株MDA-MB-231单细胞悬液后,大部存活并有肿瘤形成,局部接种点无红肿破溃表现,皮下移植瘤随时间逐渐增大,18只裸鼠有明显移植瘤形成,模型建立的成功率为100%(18/18)。A组和B组裸鼠肿瘤的体积与重量均显著大于C组(P＜0.05);A组和B组间差异没有统计学意义(P＞0.05);MS-275对移植瘤的生长抑制率在注射瘤细胞后的17天,20天,23天,26天及28天分别为14.9%;33.8%;48.7%;56.6%;63.2%。RT-PCR检测和蛋白质印迹分析:C组与A,B组比较,RECK蛋白的表达明显增强(P＜0.05),MMP-9蛋白的表达量在各个组之间未见显著性差异(P＞0.05)。结论:裸鼠的体内实验证实,MS-275适宜的浓度下,可以明显抑制裸鼠移植的乳腺癌肿瘤的生长。MS-275组裸鼠肿瘤生长速度明显减缓,肿瘤体积、重量均小于对照两组。瘤组织内HDAC1蛋白染色较对照组明显减少,同时RECK表达比对照组明显上调,虽然MMP-9表达量没有变化,但MMP-9活性降低,能够降低癌侵袭转移的发生率。MS-275抑瘤实验结果比较满意,裸鼠耐受良好,此类药物可以有效的抑制乳腺癌移植瘤的生长,因此具有良好的临床应用前景。