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目的:临床研究目的:研究益气除痰方(YQCTF)对III期肺鳞癌同期放化疗患者的客观有效率及无进展生存期的影响,以及治疗相关毒副反应,分析YQCTF对不同证型患者疗效及生存质量的影响,探讨YQCTF治疗III期肺鳞癌的优势人群。实验研究目的:通过实验,观察YQCTF对人肺鳞癌SK-MES-1细胞增殖、凋亡、周期以及对JNK、p-JNK基因的影响,探讨YQCTF抑制人肺鳞癌SK-MES-1细胞可能的分子机制。方法:临床研究方法1临床研究方法:用前瞻随机的方法将四个中心120例符合要求的患者随机为治疗组、对照组各60例,治疗组采用同期放化疗+YQCTF治疗(在益气除痰方基础上按照肺热痰瘀、脾虚痰湿、阴虚痰热、气阴两虚四种证型辨证用药),对照组采用同期放化疗,收集治疗前后患者相关资料,包括肿瘤大小、血常规、肝肾功能、中医证型、ECOG PS评分、基因(部分患者)、FACT-L4.0量表评分等,同期放化疗结束后复查相关资料评估疗效、毒副反应及生存质量量表评分,化疗结束后每2个月行CT检查评估肿瘤变化,直至肿瘤进展,记录首次化疗开始至肿瘤进展的时间,定义为PFS。选择可能影响PFS的因素纳入Cox比例风险模型,筛选出对PFS有影响的因素。2统计学方法:计量资料采用均值±标准差表示(x±S),符合正态分布且方差齐性者,采用t检验,对于不符合正态分布者改用秩和检验;所有计数资料用频数(f)和百分率或构成比(p)表示;两组等级资料采用独立样本秩和Mann-Whitney U检验;无序分类资料采用Pearson卡方检验(x2),四格表资料中出现n≥40但有1≤T<5时,用校正的卡方检验;当n<40或有T<1时,改用用Fisher确切概率法;组间无进展生存时间(PFS)差异比较采用Log-rank检验;Cox回归分析,运用Backward wald回归分析法进行多因素分析;所有数据均由SPSS 20.0进行统计。a值取0.05。实验研究方法1细胞实验制备益气除痰汤,经过人肺鳞癌SK-MES-1细胞复苏及传代,在倒置显微镜下观察细胞计数,利用公式计算细胞密度,用CCK8法检测细胞活力,倒置显微镜观察YQCTF对细胞状态的影响,Annexin V-PI双染法检测肺癌细胞凋亡率,流式细胞术细胞DNA含量测定检测细胞周期,qRT-PCR法检测JNK、p-JNK基因的表达。2动物实验构建人肺鳞癌SK-MES-1细胞裸鼠移植瘤模型,造模成功后,随机分为四组:模型组、中药组、化疗组、联合组,分别予以给药14天后,期间第1天、第5天、第9天、第14天观察体重及瘤径,处死处理后后计算瘤重,脏器组织的病理学观察,将肿瘤组织中JNK、p-JNK蛋白行Western Blot检测。结果:临床研究1临床疗效:治疗组(中药联合 CCRT 治疗)ORR 率 81.4%,DCR 率 93.1%,PFS12.5±0.85月,对照组(CCRT)ORR 率 74.1%,DCR 率 93.1%,PFS9.2±0.82 月(见表 3、表4)。两组患者治疗后的瘤体客观反应率进行秩和检验,结果无统计学差异(P＞0.05)。两组患者PFS进行Log-rank检验,结果有统计学差异(P＜0.05)。2相关预后因素对PFS的影响:2.1中医证型对PFS的影响:治疗组肺热痰瘀、脾虚痰湿、阴虚痰热、气阴两虚四种证型PFS分别为 12.3±1.25月、14.6±0.16月、8.6±1.32月、4.2±1.45月,对照组四种证型中位PFS分别为10.1±0.94月、12.4±0.70月、7.9±0.50月、5.8±1.20月,两组不同证型患者间PFS差异采用Log-rank检验,P值均小于0.01;2.2肿瘤分期对PFS的影响:治疗组Ⅲa、Ⅲb期患者的中位PFS分别为13.7±0.62月、8.7±1.94月,对照组Ⅲa、Ⅲb期中位PFS分别为 10.6±0.57月、6.9±0.80月,两组不同分期患者间PFS差异比较经Log-rank检验,P值均小于0.001;2.3治疗前PS评分对PFS的影响:全部患者治疗前按PS评分0、1、2分分3组,中位 PFS 分别为 14.60 士 1.90、11.20±0.80、8.50±0.59 月,不同组间患者 PFS差异比较经Log-rank检验,P0.005;2.4放疗不同剂量组患者PFS的差异:所有患者按实际接受放疗剂量分为标准剂量组(≥60Gy)85例、低剂量组(<60Gy)31例,结果标准剂量组及低剂量组的中位PFS分别为12.40±0.56、7.60士0.56月,不同剂量组患者间PFS差异比较经Log-rank检验,P值均小于0.01;3 PFS相关关因素Cox回归分析非基因因素:性别、T及N分期、肿瘤的客观反应、中医证型、KPS评分、骨髓抑制、消化道不良反应均为PFS不利因素,分期为PFS有利因素。基因因素:PTEN为PFS保护性因素外,HER2、PI3K、AKT、mTOR、FGFR、VEGF均为PFS不利因素。4两组患者放化疗不良反应差异对两组患者发生骨髓抑制及消化道不良反应分级分别进行独立样本秩和检验(Mann-Whitney U检验),结果发现统计结果分别为P=0.090、P=0.437,均为P＞O.05。对两组患者发生放射性肺炎的率进行pearson卡方检验,P=0.049<0.05。5两组患者治疗前后肺癌患者生存质量测定量表(FACT-L4.0)生理状况、社会/家庭状况、情感状况、功能状况及附加模块积分比较差异治疗组患者治疗后FACT-L4.0量表各模块积分均较治疗前改善(P<0.01);按中医证型分类分组统计,除气阴两虚型患者外,其他证型患者治疗后FACT-L4.0量表各模块积分均较治疗前改善(P＜0.05)。对照组患者治疗后FACT-L4.0量表各模块积分均较治疗前改善(P＜0.01);按患者中医证型分类分组统计,除脾虚痰湿型患者在5个模块积分治疗后均较治疗前有改善外(P＜0.05),其他中医证型患者治疗后FACT-L4.0量表积分均有模块积分较治疗前没有明显改善(P＞0.05)。实验研究1细胞实验CCK8法检测不同干预浓度的YQCTF作用于SK-MES-1细胞48小时后增值情况,经Oneway-ANOVA单因素分析,提示YQCTF能抑制SK-MES-1细胞增,且成浓度依赖性;流式细胞结果显示经不同浓度YQCTF干预48h后,经Oneway-ANOVA单因素方差分析,不同浓度YQCTF均能诱导缺氧SK-MES-1细胞调亡,呈药物浓度依赖效应;Oneway-ANOVA单因素方差分析提示不同浓度的YQCTF均能影响细胞周期,可明显増加GO/G1期细胞的比例,降低S期细胞和G2/M期细胞比例,在YQCTF低浓度的条件下就可使细胞周期阻滞于GO/G1期,随着YQCTF浓度的升高,阻滞于GO/G1期的细胞增多;q-PCR扩增技术显示经过不同浓度的YQCTF作用后,YQCTF组JNK无明显变化,p-JNK表达水平显著下降,且具有一定的剂量依赖效应。2动物实验(1)联合组小鼠的体重在给药前期下降,给药中后期缓慢上升;中药组小鼠的体重在给药前期、中期逐渐增加,后期出现下降;化疗组小鼠体重在前期下降,中期、后期逐渐增加;模型组小鼠的体重是在前期、中期、后期持续增加,给药过程中小鼠体重由重到轻分别为:模型组、中药组、化疗组、联合组。(2)肿瘤生长抑制率的影响:中药组、化疗组和联合组小鼠的瘤重均较模型组小鼠的瘤重小,各组与模型组比较差异均有统计学意义(P＜0.05)。联合组的瘤重比中药组小,与中药组及化疗组比较差异均具有统计学意义(P＜0.05)。(3)抑瘤率方面:中药组高于模型组,但联合组又高于中药组、化疗组。(4)肿瘤病理学影响:模型组肿瘤组织内血管丰富,细胞增殖抗原丰富,其它三组新生血管明显减少,肿瘤细胞凋亡明显增多,肿瘤细胞增殖受到显著抑制。(5)移植瘤中JNK及p-JNK表达水平:Western blotting结果显示与模型组相比,YQCTF组JNK无明显变化、p-JNK表达水平显著下降,且具有一定的剂量依赖效应,差异具有显著性意义(P＜0.05)。结论:临床研究结论:YQCTF联合同期放化疗治疗III期肺鳞癌,能延长患者PFS,降低放射性肺炎发生率,改善患者生存质量,不同中医证型患者间的疗效及生存质量改善有差异。实验研究结论:YQCTF能抑制人肺鳞癌SK-MES-1细胞增殖,阻滞细胞周期,诱导SK-MES-1细胞调亡,对SK-MES-1细胞的生长抑制作用可能与抑制JNK/SAPK的激活有关。