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第一部分探究高钙对大鼠肾小管上皮细胞中MGP表达的影响目的:研究高钙对大鼠肾小管上皮细胞(NRK-52E)中基质Gla蛋白(Matrix Gla protein,MGP)表达的影响,并探究高钙微环境下MGP在细胞钙化和钙盐沉积中发挥的作用。方法:使用高钙培养基培养NRK-52E细胞,通过流式细胞技术和CCK-8检测细胞的凋亡与增殖。使用Western blot和免疫荧光技术检测高钙对NRK52E细胞中MGP表达的影响。通过补充大鼠重组MGP增加外源性MGP、构建MGP过表达质粒上调内源性MGP的表达、构建si RNA-MGP下调内源性MGP的表达,并使用茜素红染色检测钙盐的粘附和沉积,研究调控MGP表达对细胞钙化和钙盐沉积的影响。结果:高钙可以抑制NRK-52E细胞的增殖并促进细胞凋亡,在高钙微环境下会发生细胞钙化和钙盐沉积。此外,高钙可以抑制NRK-52E细胞中MGP的表达。补充外源性重组MGP或者上调内源性MGP的表达,可以抑制高钙微环境下细胞的钙化和钙盐沉积,下调内源性MGP的表达则促进细胞钙化和钙盐沉积。结论:高钙通过抑制NRK-52E细胞中MGP的表达,促进了细胞的钙化和钙盐沉积。第二部分调控MGP羧化状态对肾结石形成的影响及其机制研究目的:研究调控谷氨酸羧化酶(Glutamylcarboxylase,GGCX)和补充维生素K(Vimatin K,Vit K)、华法令对大鼠MGP羧化状态的影响,并探讨MGP羧化状态影响高钙尿大鼠肾结石形成的机制。方法:细胞实验分组如下,研究GGCX对MGP羧化状态的影响:GGCX干扰/过表达的NRK-52E细胞+正常或高钙培养基。研究Vit K、华法令对大鼠MGP羧化状态的影响,空白对照组:NRK-52E细胞+正常或高钙培养基;Vit K1组:NRK-52E细胞+Vit K1+正常或高钙培养基;Vit K2组:NRK-52E细胞+Vit K2+正常或高钙培养基;华法令组:NRK-52E细胞+华法令+正常或高钙培养基;溶剂对照组:NRK-52E细胞+溶剂+正常或高钙培养基。使用Elisa试剂盒测定各组细胞上清中未羧化的MGP(ucMGP)和MGP的水平,Western blot检测细胞中MGP、BMP2、OPN和Runx2的表达情况,探针检测钙离子内流的情况。动物实验分组如下,空白对照组:正常饮食和饮水;1,25(OH)2D3组:腹腔注射1,25(OH)2D3构建高钙尿结石大鼠模型;Vit K2组:隔日腹腔注射Vit K2+1,25(OH)2D3;华法令组:隔日腹腔注射华法令+1,25(OH)2D3;氢氯噻嗪组:隔日腹腔注射氢氯噻嗪+1,25(OH)2D3。第12周末处死大鼠,收集各组大鼠的24h尿液、血液和肾组织标本。记录尿量并测定尿钙、尿磷水平,测定凝血功能、肝肾功能、血钙、血磷、血ucMGP和血Vit K2水平,免疫组化检测肾组织中MGP、骨形态发生蛋白-2(BMP2)和骨桥蛋白(OPN)的表达水平,硝酸银染色检测钙盐沉积,Tunel染色检测组织中的凋亡情况。结果:正常情况下,在NRK-52E细胞中调控GGCX并不影响MGP的表达,但是干扰GGCX可以抑制MGP的羧化,使细胞上清中ucMGP水平升高。高钙环境下,过表达GGCX可以促进MGP的羧化,使细胞上清中ucMGP水平降低并抑制NRK-52E细胞中BMP2和OPN的表达,而干扰GGCX则促进了BMP2和OPN的表达。补充Vit K1、Vit K2和华法令也不影响NRK-52E细胞中MGP的表达,但是Vit K1、Vit K2可以降低ucMGP的水平,并抑制高钙环境下NRK-52E细胞中BMP2、OPN的表达,且Vit K2的效果更为显著。而华法令阻碍了MGP的羧化,使得ucMGP的水平升高。此外,补充Vit K还可以抑制高钙环境下NRK-52E细胞中钙离子的内流。我们通过腹腔注射1,25(OH)2D3构建了高钙尿结石形成大鼠模型,在补充Vit K2和氢氯噻嗪后,该类大鼠肾组织中钙盐沉积、凋亡发生和OPN的表达明显减少。Vit K2组的血ucMGP水平和肾组织中BMP2的表达明显低于1,25(OH)2D3组,而氢氯噻嗪组的血ucMGP水平和肾组织中BMP2的表达与1,25(OH)2D3组相比无明显差异。补充华法令后,高钙尿结石形成大鼠肾组织中钙盐沉积明显增多,且该组大鼠血ucMGP水平、肾组织中BMP2和OPN的表达水平、组织凋亡水平也明显高于1,25(OH)2D3组。结论:上调GGCX或补充Vit K可以促进肾小管上皮细胞和大鼠体内MGP的羧化,抑制高钙环境下肾小管上皮细胞和肾组织中BMP2信号通路的激活,从而抑制结石形成。第三部分血ucMGP水平与肾结石复发的相关性研究目的:测定肾结石患者血中未羧化的MGP(un-carboxylated Matrix Gla Protein,ucMGP)的水平,探讨血ucMGP水平与肾结石复发的相关性。方法:纳入至我院接受治疗的肾结石患者,排除伴有发热、血尿、留置肾造瘘管或尿管、泌尿系统畸形或者泌尿系统结核的患者,排除一个月内有Vit K或华法令服用史的患者。根据患者结石复发的病史,将患者分为结石初发组和结石复发组。收集患者的年龄、性别、身高、体重、高血压、糖尿病病史、吸烟、饮酒史、结石复发史、结石家族史、尿常规、血生化等临床资料。收集患者的血液标本,Elisa试剂盒测定患者血浆ucMGP的水平。收集患者的24h尿液标本,记录尿量并测定尿钙、尿草酸的水平。比较结石初发组和复发组各临床指标的差异,采用多因素Logistic回归分析研究患者年龄、高血压、糖尿病病史、BMI、血ucMGP水平、尿量、24h尿草酸排泄、24h尿钙排泄以及高尿酸血症与结石复发的相关性。结果:我们总共纳入了91名肾结石患者,其中初发者48名、复发者43名。两组患者的性别、年龄、BMI、血钙、血磷、血镁、血尿酸水平、以及高血压病史、糖尿病病史、结石家族史、吸烟史、饮酒史均没有显著的统计学差异,具有较好的可比性。结石复发患者的血ucMGP水平明显高于结石初发者(2946.06ng/m L vs 2250.78ng/m L,P<0.05),但是两组的24h尿草酸、尿钙水平并无明显差异。多因素Logistic回归分析结果显示,血ucMGP≥2400ng/m L和24h尿草酸排泄量≥25mg是肾结石复发的危险因素。血ucMGP≥2400ng/m L的患者结石复发的风险是其他患者的3.035倍(OR 3.035,95%CI 1.115-8.859,P=0.03),而24h尿草酸排泄量≥25mg的患者结石复发的风险是其他患者的3.586倍(OR 3.586,95%CI 1.092-11.779,P=0.035)。结论:肾结石患者血ucMGP≥2400ng/m L和24h尿草酸排泄≥25mg是结石复发的危险因素。第四部分肾结石患者尿液外泌体的高通量蛋白组学研究目的:越来越多的研究报道外泌体与肾结石的发生有关,但其发挥的作用并不清楚。我们对肾结石患者的尿液外泌体进行高通量蛋白组学研究,拟探究尿液外泌体在肾结石形成中发挥的潜在作用。方法:本研究纳入了肾结石患者和与之年龄/性别匹配的健康对照各6名(排除血尿、泌尿系感染和其他器质性疾病),分别收集晨尿200-300m L,使用超速离心的方法从尿液中分离外泌体,并通过电镜、纳米颗粒追踪技术以及Western blot技术对提取的外泌体进行鉴定。使用丙酮沉淀的方法提取尿液蛋白。使用非标记液相串联质谱技术对尿液外泌体中包含的蛋白质进行高通量组学分析,利用生物信息学技术筛选出与结石形成相关的差异蛋白,并通过Western blot对目标蛋白进行验证。结果:尿液外泌体呈双层膜囊泡结构,高表达CD9、TSG101、HSC70等经典外泌体标志物,NTA结果显示其直径集中分布在50nm-80nm。我们在结石组和对照组的尿液外泌体中共鉴定到960种蛋白质,其中16种蛋白在两组尿液外泌体中的表达具有显著差异(P<0.05,log FC>3.146 or log FC<-3.403)。生物信息学结果显示,尿液外泌体在结石形成过程中可正向调控免疫反应和MAPK通路,差异蛋白主要在钙离子结合(GO:0005509)和炎症反应(GO:0045087)中发挥作用。我们筛选了这两条通路中共同的蛋白分子(S100A8、S100A9、S100A12)进行后续研究,Western blot结果证实S100家族蛋白在肾草酸钙结石患者尿液外泌体中的表达明显升高。此外,尿液蛋白中几乎检测不到S100家族蛋白,S100A8、S100A9、S100A12在尿液外泌体中呈特异性聚集。结论:肾草酸钙结石患者尿液外泌体中S100A8、S100A9、S100A12的表达明显升高并呈特异性聚集,主要在钙离子结合和炎症反应中发挥作用,有可能成为新的结石疾病标志物。