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昆虫在面对外界各种极端环境压力和病原体侵染的过程中,进化出了一套由体液免疫和细胞免疫组成的独特免疫系统,主要依赖血液中的抗菌肽和细胞因子发挥作用。昆虫ENF肽作为一种细胞因子,广泛存在于鳞翅目昆虫中,且已经被证明可以激活免疫反应,对机体进行自我保护。同时,昆虫体内还存在一类ENF肽结合蛋白,可以通过与ENF肽结合并抑制其活性,从而起到免疫负调控的作用。这种由ENF肽与ENF肽结合蛋白共同调控的免疫应答反应属于机体自我保护的一种反馈调节。但目前对于ENF肽参与的免疫反应的研究主要集中在其上游的激活通路中,而对于其下游的免疫解除过程却知之甚少。因此,阐明ENF肽结合蛋白在免疫反应中的作用机制,对理解昆虫基本的免疫调节过程,尤其是下游的免疫解除机制具有重要意义。本文以家蚕ENF肽结合蛋白（BmENF-BP）为研究对象,采用结构生物学手段来阐释ENF肽结合蛋白结合家蚕ENF肽（PP）的结构基础和分子机制,同时围绕ENF肽结合蛋白在ENF肽参与免疫反应中扮演的角色展开研究。获得的主要成果如下:1、家蚕ENF肽结合蛋白的三维结构解析我们采用原核表达及纯化获得高纯度的BmENF-BP蛋白,经过晶体筛选和优化获得了 BmENF-BP晶体,并通过X-射线衍射的方法收集到3A的数据,最终解析了 BmENF-BP的三维结构。BmENF-BP的整体结构可分为3个结构域:恶臭假单胞菌的同源区域（PPD）、全α螺旋结构域和全β折叠结构域。其中N端结构域由8个β折叠片和4个α螺旋组成,β折叠与α螺旋之间通过loop相连。N端结构域含有大量的loop区域,推测其可能是结合ENF肽的结合区域。而全α螺旋结构域和全β折叠结构域与家蚕经典30K蛋白BmLP7的全α螺旋结构域和全β折叠结构域高度相似,因此BmENF-BP可能具有与BmLP7相同的、结合某脂类物质的功能。为确定ENF肽结合蛋白的全α螺旋结构域和全β折叠结构域对其N端结构域折叠和功能的影响,我们单独表达了 BmENF-BP的N端结构域,并对其进行蛋白纯化与结晶、以及三维结构解析,最终得到了单独N端结构域的三维结构。将单独的N端结构与BmENF-BP中的N端结构域进行叠合比较和RMSD计算分析,我们发现二者高度相似,RMSD值为0.265A,表明N端结构域作为一个单独的结构域是十分稳定的。2、家蚕ENF肽结合蛋白与其配体PP的结合位点分析由于BmENF-BP蛋白及单独的PPD结构域蛋白分别与PP共结晶后均未获得复合物晶体。我们尝试将PP与BmENF-BP-N蛋白通过linker连接的方式进行融合表达,并获得了 PP-ENF-BP-N融合蛋白;使用晶体筛选、优化以及X-射线衍射等方法收集到复合体的衍射数据。解析该复合体结构时发现,N端结构可以成功搭建出来,而配体PP部分由于其电子云图完整度较低,只能确定大致位置即PP结合在NF-BP-N的N端。接着,我们基于该结合的大致区域对BmENF-BP和PP进行了分子对接模拟,获得了 BmENF-BP与PP的复合体模型。从结构模型上看,N端结构域N端的表面具有酸性沟槽,而PP肽有大片的碱性界面,这就为BmENF-BP与配体PP的结合提供适宜的环境。我们还通过结合实验确定了 BmENF-BP只与PP-Reduced结合,因为还原肽的PP使得自身的碱性界面暴露,更容易与BmENF-BP结合。随后,我们对酸性沟槽中8个可能直接参与BmENF-BP与PP-Reduced结合的氨基酸进行定点突变以及结合能力分析,确定BmENF-BP蛋白的E19、E23、D25和D 27等4个氨基酸直接参与了 PP-Reduced的结合,E15、E16、E30、D31等4个氨基酸在PP-Reduced与BmENF-BP结合中起辅助作用。3、家蚕ENF肽结合蛋白在PP参与的家蚕免疫应答中扮演的角色对家蚕五龄第3天幼虫进行PP及病原菌注射的研究发现,两者均能够诱导BmENF-BP基因和下游抗菌肽基因的表达,这表明PP能够激活家蚕的体液免疫。定量结果显示,BmENF-BP基因的诱导表达出现在抗菌肽基因被诱导之后。这暗示了 BmENF-BP应该是在体液免疫激活之后发挥作用,可能与免疫的解除有关。另外,PP与受体（BmE细胞）的结合能力比PP与BmENF-BP弱,表明BmENF-BP可以将PP从受体上竞争性结合下来,从而终止免疫。BmENF-BP、BmE细胞和PP的共定位结果显示,BmE细胞膜上的受体只能与PP-Oxidized结合,而BmENF-BP只能与PP-Reduced结合。且只有当PP-Oxidized与BmE细胞膜受体结合后,BmENF-BP才能被共定位在BmE细胞膜上。这表明PP-Oxidized与细胞膜上受体结合后会发生构象变化,该变化可能模拟了 PP还原态的构象（或者直接变为还原态）,而后者会与BmENF-BP结合从使免疫终止。综合以上结果,我们对PP调控的体液免疫应答信号通路模型假设如下:氧化态的活性PP与细胞上的受体结合并激活体液免疫,同时PP因被受体结合发生构象变化,变得容易被BmENF-BP识别和结合。因为BmENF-BP通过竞争性结合的方式将PP从受体上竞争下来以解除持续的免疫刺激,从而使机体保持稳态。对于PP由氧化态到还原态的转变,我们有两种猜想:①受体使PP由氧化态转变成还原态;②外源刺激引发体液中PP从氧化态变成还原态。为验证以上结论及猜想,我们通过免疫共沉淀法联用质谱检测鉴定PP的受体蛋白,经过功能注释最终筛选出10种可能的靶标蛋白,为进一步的研究奠定基础。