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紫杉醇作为一种常用化疗药,用来治疗乳腺癌和卵巢癌等癌症,常会导致病人产生剂量依赖性的外周神经痛。治疗停止后一部分病人疼痛不消失,仍持续很长时间,严重降低了生活质量。这种疼痛至今没有有效治疗方法,原因在于其发病机制不明。背根神经节(Dorsal Root Ganglion, DRG)作为痛觉传入的第一级神经元,在痛觉的信号传导中起着重要作用。它接收外周感觉神经末梢的信号,将其整合后向脊髓传送,所以有关疼痛病理机制的研究很多都集中在DRG神经元上。现认为DRG神经元的高兴奋性,在自发痛和触觉痛敏中起到关键性作用,是导致疼痛的外周敏化机制之一。而神经元兴奋性增高是由于其细胞膜上离子通道改变导致。电压门控钠离子通道是可兴奋细胞产生动作电位的基础。基因SCN9A编码的Navl.7钠通道现已成为治疗疼痛的关键性靶点。研究发现Nav1.7基因突变可导致人类产生多种先天性疼痛相关疾病。在动物多种疼痛模型,比如炎性痛、糖尿病神经痛和坐骨神经慢性压迫性损伤疼痛模型中均发现Nav1.7蛋白表达增高。但在紫杉醇外周神经痛模型中没有相关研究,本课题旨在研究Nav1.7钠通道是否参与了紫杉醇诱导外周神经痛的发病机制。第一部分紫杉醇诱导外周神经痛大鼠背根神经元电生理学特性的改变目的：运用膜片钳技术研究紫杉醇诱导外周神经痛大鼠DRG(Dorsal Root Ganglion,DRG)神经元电生理特性的改变。方法：成年SD大鼠20只,体重150-200g,随机分为2组：对照组(vehicle组,n=10)和紫杉醇组(P组,n=10)。采用腹腔隔天注射紫杉醇(2mg/kg,共四次)的方法制备外周神经痛模型,对照组注入等容量氢化蓖麻油：无水乙醇(1：1)。紫杉醇腹腔注射后8～10天,急性分离大鼠L4-L5背根神经元细胞,建立膜片钳全细胞电流钳模式,记录大、中、小直径神经元的动作电位、静息膜电位、自发放电细胞个数、输入阻抗以及动作电位基强度的改变。结果：同vehicle组相比,紫杉醇增加背根神经元自发放电比例,这种改变主要集中在大直径和中直径DRG神经元上(P<0.05)。对照组中没有观察到中、小直径神经元自发放电现象。紫杉醇注射减少了大、中直径神经元的基强度(P<0.05),但在小直径神经元两组基强度没有差异(P>0.05)；两组间神经元的静息膜电位绝对值和输入阻抗差异没有统计学意义(P>0.05)。结论：紫杉醇导致大鼠背根神经节神经元兴奋性增高,可能是其外周神经痛机制之一。第二部分紫杉醇诱导外周神经痛大鼠背根神经节Nav1.7钠通道的改变目的：观察背根神经节(Dorsal Root Ganglion, DRG)中Nav1.7钠通道在大鼠紫杉醇诱导外周神经痛模型中的变化。方法：雄性SD大鼠,体重220-300g。36只大鼠随机分为2组：对照组(vehicle组,n=18)和紫杉醇组(P组,n=18)。采用腹腔隔天注射紫杉醇(2mg/kg,共四次)的方法制备紫杉醇诱导外周神经痛模型,对照组注入等容量氢化蓖麻油：无水乙醇(1：1)。采用电子von Frey法于腹腔注射前(基础值)和注射后第7、14和21天,测定各组大鼠体重及机械缩足反应阈(PWT)。并于痛域测定完毕后各时间点每组分别处死6只大鼠,取L4-5节段双侧DRG,采用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)和Western blot检测法测定Navl.7mRNA和蛋白表达水平。结果：注射后7～21天,同vehicle组相比,P组大鼠后肢机械缩足反射阈值显著下降；伴随Nav1.7mRNA以及蛋白表达水平增高(P<0.05)。结论：紫杉醇导致背根神经节Nav1.7钠通道mRNA和蛋白表达增高,可能是紫杉醇诱导外周神经痛的机制之一。第三部分抑制Nav1.7表达的shRNA慢病毒载体的构建目的：设计合成针对大鼠Nav1.7基因的shRNA,构建慢病毒载体。方法：根据RNAi原理及shRNA设计原则,设计shRNA并将其与GV248载体连接,体外转染经NGF诱导的PC-12细胞。96h后显微镜下观察细胞转染效率,并用RT-PCR和Western-Blot法检测Nav1.7mRNA及蛋白水平的改变。结果：构建的慢病毒载体可有效转染PC-12细胞,转染率达到80%。慢病毒载体在96h时可以显著抑制细胞Navl.7的mRNA及蛋白表达水平(P<0.05)。结论：成功构建了针对Nav1.7的慢病毒载体,为进一步动物实验研究Nav1.7基因功能奠定了基础。第四部分DRG显微注射shRNA慢病毒载体抑制Nav1.7表达对大鼠紫杉醇诱导外周神经痛的影响目的：观察DRG显微注射Nav1.7 shRNA慢病毒载体对紫杉醇诱导外周神经痛大鼠的影响。方法：成年SD大鼠36只,体重180-220g,随机分为3组：紫杉醇+PBS组(PBS组,n=12),紫杉醇+阴性对照病毒组(LV-Con-EGFP组,n=12)和紫杉醇+Navl.7shRNA慢病毒载体组(LV-Navl.7-EGFP组,n=12)。各组大鼠行左侧L4-5DRG显微注射,注射试剂分别为：PBS,阴性对照病毒液和Nav1.7慢病毒液。每只大鼠每个DRG节注射2μl,共4μl。显微注射7天后,按前述方法建造紫杉醇外周神经痛疼痛模型。分别于DRG显微注射前(基础值)、紫杉醇注射前1天(OD)和注射后第7天(7D)测定大鼠左后肢机械缩足阈值(PWT),于建模后第0和7D每组处死6只大鼠,取左侧L4-5 DRG,用RT-PCR和Western-Blot方法检测大鼠Navl.7的表达。结果：同PBS组相比,建模后第7D, Nav1.7 shRNA慢病毒组大鼠左侧后肢机械缩足阈值显著升高(P<0.05),但是没有恢复到紫杉醇腹腔注射前的基础值(P<0.05)；同PBS组相比,第7D阴性对照组PWT值没有明显差异(P>0.05)；同时,第7D时,同PBS组相比,慢病毒组Navl.7蛋白和mRNA基因表达显著降低(P<0.05)。结论：DRG显微注射Nav1.7 shRNA慢病毒载体有效抑制Navl.7蛋白和mRNA表达,减轻了大鼠紫杉醇诱导外周神经痛。