激酶催化磷酸化是生物体内一种普遍的生理调控机制,在细胞的信号转导、基因的表达以及生命体的新陈代谢等过程中都具有非常重要的作用。据统计,在人体内有超过2000种激酶,人类许多疾病如癌症、阿兹海默症和糖尿病等都与激酶和磷酸化的异常表达密切相关。因此,研究磷酸化过程和分析激酶活性,受到了研究者们的广泛关注。电化学生物传感器是通过测定与目标物作用后产生的电极表面电化学信号改变来实现对目标的分析,具有操作简便、响应快速、灵敏度高、选择性好等优点。目前,电化学生物传感器的研究和应用发展十分迅速,已不断应用于化学、生命科学、生物医学、环境监测、食品、医药和军事等领域,这也为磷酸化和激酶活性的研究提供了新契机。基于此,本论文在大量文献调研的基础上,以激酶活性的高灵敏检测为目标,结合纳米材料和核酸自组装信号放大优势,发展简便、快速且通用的异相和均相电化学生物传感器,具体完成了以下研究工作:一、基于正电荷金纳米颗粒/碳纳米管纳米复合物信号放大电化学检测蛋白激酶A活性利用正电荷金颗粒/碳纳米管(AuNPs/MWNTs)纳米复合物放大电化学信号,发展了一种高灵敏的电化学生物传感器用于蛋白激酶A(PKA)活性及其抑制剂分析。该方法结合正电荷金纳米颗粒(AuNPs)的类过氧化物酶特性和多壁碳纳米管(MWNTs)的比表面积大、加快电子传递效率特点来实现PKA活性的灵敏检测。首先利用EDC/NHS催化酰胺化反应,将表面带有氨基的AuNPs与表面为羧基的MWNTs共价交联合成AuNP/MWNTs纳米复合物。当PKA存在时,可将修饰在金电极表面的底物肽催化磷酸化。此时,ATP的γ位上标记的巯基可随激酶催化磷酸化过程而转移到底物肽上。因此,在金-巯键的作用下,AuNP/MWNTs纳米复合物可组装到金电极表面并催化双氧水与四甲基联苯胺(TMB)发生氧化还原反应产生放大的电化学信号,且电化学信号强度与PKA浓度正相关。利用该方法能实现PKA活性的灵敏分析,得到的检测限为0.09 U/mL,线性响应浓度范围为0.10 U/mL～1 U/mL。同时,该方法还被用于考察PKA的抑制实验和特异性实验研究。二、基于DNA酶和金纳米颗粒双猝灭石墨烯量子点电化学发光检测蛋白激酶A活性利用G-四聚体与氯高铁血红素(Hemin)结合后形成的DNA酶和金纳米颗粒(AuNPs)都能猝灭石墨烯量子点(GQDs)电化学发光的特性,发展了一种高灵敏的电化学发光生物传感器用于蛋白激酶A(PKA)活性及其抑制剂的检测。在此方法中,我们首先通过共价交联的方式将底物肽交联到修饰有GQDs的氧化铟锡(ITO)电极表面。在共反应剂H2O2存在的情况下,修饰有底物肽和GQDs的ITO电极可检测到很强的电化学发光信号。当PKA存在时,底物肽发生磷酸化,此时,利用Zr4+能介导两个磷酸基团特异性结合的特点,修饰有磷酸化DNA和DNA酶的AuNPs(pDNA@DNAzyme-AuNPs)可与磷酸化底物肽结合,进而组装到电极表面。双氧水作为电化学发光的共反应剂,可在DNA酶的催化下含量降低而使电化学发光信号随之降低。同时,由于AuNPs与GQDs之间的电化学发光能量共振转移作用,电化学发光信号可进一步被猝灭。因此,结合DNA酶催化双氧水反应和电化学发光能量共振转移,电化学发光信号发生很大的降低,从而实现PKA活性高灵敏检测。实验结果表明,该方法对PKA活性分析的线性范围为0.05～5 U/mL,检测限为0.04 U/mL。基于此方法,我们还进一步对其抑制实验、干扰实验及复杂样中的实际检测进行了考察。表明该方法在药物筛选以及临床研究中具有潜在的应用价值。三、基于核酸动态自组装构建的均相电化学传感策略用于T4多核苷酸激酶放大检测在本工作中,我们利用G-四聚体和双链DNA对亚甲基蓝(MB)的高效吸附特性以及核酸动态自组装信号放大策略,发展了一种快速、简便且免标记的均相电化学传感器用于T4多核苷酸激酶(T4PNK)的放大检测。我们首先设计了四种发夹DNA,分别为T4HP、HP1、HP2和HP3。T4HP为颈部两端平齐的发夹DNA,HP1、HP2和HP3则为三条处于亚稳态的发夹DNA,且在它们颈部两端都突出延长一段富G碱基序列的单链DNA。当T4PNK存在时,T4HP的5’-羟基端被催化磷酸化,此时,λ核酸外切酶(λexo)能特异性识别磷酸化的T4HP,并沿着5’-3’方向对T4 HP进行切割水解,而释放出一条触发单链DNA。该触发DNA可与HP1部分互补杂交打开HP1,被打开的HP1则与HP2部分互补杂交打开HP2,被打开的HP2可进一步打开HP3。最后被打开的HP3与打开的HP1杂交将触发DNA竞争下来并形成类“Y”字型结构的DNA聚合体,同时使富G碱基序列相互靠近形成G-四聚体。被竞争下来的触发DNA可不断用于下一轮的触发循环,形成大量含G-四聚体的类“Y”字型结构DNA聚合体。由于类“Y”字型结构的DNA聚合体上G-四聚体能有效地吸附溶液中电信号分子MB,从而使靠近电极表面的MB减少,降低电信号,实现目标物T4PNK的放大检测。利用该方法能实现T4PNK活性的灵敏分析,得到的检测限为0.09 U/mL,线性响应浓度范围为0.10 U/mL～10 U/mL。该方法简便,快速,为非放射性检测T4 PNK活性提供了一种新的思路,并且可以实现对T4PNK抑制剂的筛选,使其在临床研究中具有潜在的应用价值。四、基于介孔硅膜和羧肽酶选择切割多肽构建免标记均相电化学传感平台用于蛋白激酶的检测利用介孔硅膜(MSFs)垂直有序分布的纳米孔和羧肽酶(CPY)选择性切割底物肽的特性,我们发展了一种简便、有效的免标记型均相电化学传感平台用于蛋白激酶及其抑制剂的灵敏检测。在此传感平台中,我们首先设计了一种特定底物肽序列,此底物肽序列含有两部分,一部分为蛋白激酶特性识别序列,另一部分则为富精氨酸序列用于确保底物肽在磷酸化前后都为正电荷,使底物肽可通过静电吸附的方式吸附在表面为负电荷的介孔硅膜电极表面而封堵介孔,阻碍电活性探针(FcMeOH)靠近电极表面。当蛋白激酶不存在时,底物肽可以被CPY水解成游离的氨基酸,这些游离氨基酸不能吸附在介孔硅膜的表面上,因此溶液中大量游离的FcMeOH可通过介孔硅膜靠近电极,产生电信号。然而,当蛋白激酶存在时,底物肽发生磷酸化,从而抑制CPY水解,此时未水解的磷酸化底物肽可吸附在介孔硅膜电极表面,封堵介孔使电信号降低。电化学信号下降的大小与混合液中磷酸化底物肽的浓度相关,这也对应了蛋白激酶的活性大小。在该方法中,我们分别将蛋白激酶A(PKA)和酪蛋白激酶Ⅱ(CK2)作为目标蛋白激酶,实现了其灵敏检测,其检测限分别为0.08 U/mL和0.09 U/mL。此外,其抑制实验以及复杂样中的实际检测表明该方法在药物筛选以及临床研究中具有潜在的应用价值。五、基于介孔硅膜构建的免标记和通用型电化学发光核酸适配体传感平台本工作通过将核酸适配体(Aptamer)构建的门控系统与介孔硅膜(MSFs)相结合,构建了一种快速、简便且免标记的电化学发光适配体传感平台用于酶、生物小分子和离子的检测。在此方法中,我们首先采用Stober-solution方法在氧化铟锡(ITO)电极表面原位生长一层MSFs,并对其表而进行氨基化修饰,然后将电化学发光分子Ru(bipy)32+装载进MSFs里面。此时,带负电荷的Aptamer可通过静电吸附方式吸附在MSFs功能化电极表面并有效封堵介孔而阻止Ru(bipy)32+泄露。因此,被Aptamer包裹且装载有Ru(bipy)32+的MSFs功能化电极(Apt-Ru@MSFs/ITO)可产生强而稳定的电化学发光信号。当目标物存在时,目标物和Aptamer特异性识别,使Aptamer从MSFs表面游离下来,介孔打开,释放Ru(bipy)32+分子,致使电化学发光信号降低,从而实现目标物的检测。在该方法中,我们分别把溶菌酶、腺苷和K+作为模式目标分子,实现了其灵敏检测,其检测限分别为0.06 nM、0.75 nM和0.50 μM。结果表明,通过改变Aptamer序列,该方法可作为一种通用平台用于其它目标物的检测。