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类风湿关节炎(rheumatoid arthritis,RA)是一种以关节滑膜炎症为主要病理表现的慢性自身免疫性关节疾病。发病时,关节滑膜最先受累,其病理组织学的变化为在多种炎性因子的刺激下,关节滑膜类肿瘤样无限增生、新血管形成、关节囊增厚,增生的滑膜表面形成血管翳,逐渐向关节面和关节软骨扩展、侵蚀,并最终破坏关节软骨和软骨下骨,使关节畸形和失去功能。关节炎治疗的首要目的是控制炎症、阻止关节破坏。由于RA的发病机制尚不清楚,目前还没有令人满意的疗法。木瓜苷(glucosides of Chaenomeles speciosa,GCS)是课题组从木瓜中提取分离得到的抗炎镇痛有效部位,儿茶素[(+)-catechin,Cat)]是从木瓜中得到的单体。本课题组前期研究表明,GCS具有抗炎和镇痛作用,可减轻佐剂性关节炎(adjuvant arthritis ,AA )大鼠和胶原性关节炎(collagen-induced arthritis,CIA)大鼠的继发性足肿胀、关节疼痛、多发性关节炎等表现,还可恢复体重,改善关节病理形态学的异常。GCS对关节炎大鼠的治疗作用与其介导大鼠滑膜细胞鸟苷酸结合蛋白(Guanine nucleotide- binding proteins,简称G蛋白)偶联信号转导有关,即GCS通过抑制关节炎大鼠滑膜细胞Gαi mRNA表达,增强Gαs mRNA表达,使第二信使环磷酸腺苷(cyclic adenosine monophophate, cAMP)生成增加,从而调节过高的滑膜细胞的分泌功能和增殖能力。本课题组前期研究发现白芍总苷可通过抑制AA大鼠滑膜组织有丝分裂原蛋白激酶信号通路活化和通过改善滑膜细胞的功能延缓AA滑膜增生和软骨破坏;白芍总苷还可调节G蛋白偶联前列腺素受体的表达。本研究在复制大鼠AA病理模型的基础上,探讨Cat和GCS对大鼠AA的治疗作用;并从对AA大鼠滑膜细胞G蛋白偶联前列腺素受体表达和脱敏的影响来阐明GCS和Cat可能的作用机制。目的:根据大鼠AA的关节局部肿胀、疼痛、多发性关节炎及病理形态学等改变,明确Cat对大鼠AA的治疗作用及Cat是否是GCS发挥作用的主要有效成分之一;以AA发病的靶细胞—滑膜细胞为突破口,探讨GCS和Cat抑制AA大鼠关节滑膜细胞的增殖与cAMP水平之间的关系;选择AA滑膜细胞的G蛋白偶联前列腺素受体EP2的脱敏机制为切入点,分析GCS和Cat是否通过影响AA大鼠关节滑膜细胞G蛋白偶联前列腺素受体EP2的脱敏而发挥效应?方法:大鼠足跖皮内注射完全弗氏佐剂(Freund’s completed Adjuvant, FCA)诱发大鼠AA模型;以GCS和Cat 30,60,120 mg·kg-1治疗给药(ig,d 17~d 24),雷公藤多苷(GTW)40 mg·kg-1为阳性对照。足容积法测量继发侧足肿胀度;进行疼痛评分和多发性关节炎评分;光学显微镜观察关节组织病理学变化;Ⅱ型胶原酶和胰蛋白酶消化法、组织块移植法分离培养大鼠的滑膜细胞;MTT法检测滑膜成纤维细胞的增殖反应;小鼠胸腺细胞增殖法测定滑膜细胞产生IL-1水平;放射性免疫法测定滑膜细胞中TNFα和PGE2含量;放射性免疫法测定滑膜细胞cAMP水平。采用Western blot技术检测滑膜组织和细胞中EP2、GRK2、β-arrestin1的表达变化。结果:1. GCS和Cat对AA大鼠具有治疗作用应用FCA诱导大鼠AA模型,其继发性反应表现为以多发性关节炎为特征的关节肿胀和触痛、活动障碍等类似RA的症状。病理学改变可见滑膜组织充血、水肿、增生;淋巴细胞、单核细胞及少数散在分布的中性粒细胞浸润;血管翳形成;软骨表层组织变性、坏死;软骨破坏、肥大、剥脱或断裂,被纤维血管所取代;胶原纤维增生;骨髓腔内骨髓细胞减少,脂肪细胞大量增多。GCS(30,60,120 mg·kg-1)和Cat(60,120 mg·kg-1)治疗给药(ig,d 17~d 24)均可不同程度明显减轻AA大鼠的继发性足肿胀、关节疼痛、多发性关节炎等症状;光镜下观察关节滑膜组织中轻度的滑膜增生、淋巴细胞浸润减少;滑膜下有少量纤维增生、血管翳减轻,其中的新生毛细血管数量减;软骨受损程度减轻,仅见少量炎细胞;骨髓腔中脂肪细胞明显减少、骨髓细胞密集。充分显示了GCS和Cat对AA大鼠具有治疗作用,并且GCS降低多发性关节指数作用更显著。2、GCS和Cat抑制滑膜细胞分泌PGE2、IL-1、TNFα等炎性细胞因子,提高胞内cAMP水平,抑制滑膜细胞过度增殖GCS和Cat体内给药(30,60,120mg/kg, ig, d17-24)可显著抑制AA大鼠滑膜细胞培养上清中过高的PGE2、IL-1和TNFα水平,并且GCS对滑膜细胞分泌PGE2和TNFα的抑制作用更明显。GCS(30,60,120mg/kg, ig, d17-24)和Cat (60,120mg/kg, ig,d17-24)体内给药、GCS(12.5-100μg/ml)和Cat (25-100μg/ml)体外给药可抑制AA大鼠FLS的过度增殖,升高细胞内cAMP水平,相关性分析表明GCS和Cat抑制AA大鼠FLS的增殖与其提高细胞内cAMP水平密切相关。IL-1α(10ng·ml-1)刺激使AA大鼠FLS中cAMP水平下降,PGE2水平升高。GCS(12.5~100μg·ml-1)、Cat(12.5~100μg·ml-1)均显著降低IL-1α刺激的FLS中PGE2水平;GCS(12.5~100μg·ml-1)、Cat(25~100μg·ml-1)均显著提高IL-1α刺激的FLS中cAMP水平。3、GCS和Cat上调AA大鼠滑膜组织EP2受体的表达AA大鼠滑膜组织中EP2表达减弱,GCS和Cat体内给药(60,120mg/kg, ig, d17-24)可促进EP2的表达,提示调节G蛋白偶联EP2受体的表达,恢复滑膜细胞EP2-G蛋白-cAMP信号的正常转导可能是GCS和Cat发挥抑制滑膜增殖作用的主要机制之一。4、GCS和Cat促进AA大鼠FLS细胞膜GRK2及β-arrestin1的表达Western blot法检测结果表明,IL-1α预处理的AA大鼠成纤维滑膜细胞GRK2及β-arrestin1蛋白膜表达量显著减少,GCS(50,100μg/ml)和Cat (50,100μg/ml)能显著提高细胞膜GRK2及β-arrestin1蛋白的表达,提示GCS和Cat通过调节G蛋白偶联EP2受体的表达和脱敏,而保持EP2-G蛋白-cAMP信号的正常转导是其发挥作用的重要机制之一。结论:1、GCS和Cat对AA大鼠关节局部肿胀、疼痛、多发性关节炎及病理形态学等改变具有明显的治疗作用。2、GCS和Cat通过抑制滑膜细胞分泌IL-1、TNFα及PGE2等环节而降低AA大鼠关节滑膜细胞过高的分泌功能;通过上调胞内的cAMP水平而抑制滑膜细胞的增殖。3、GCS和Cat能上调AA大鼠滑膜组织EP2的表达。IL-1α可能阻碍了GRK2和β-arrestin1的转膜,从而抑制了EP2受体的脱敏。GCS和Cat通过促进AA大鼠成纤维滑膜细胞膜GRK2及β-arrestin1的表达而调节G蛋白偶联EP2受体的脱敏,表明GCS和Cat可能是通过调节EP2-G蛋白-cAMP信号的正常转导而减轻大鼠AA。