论文部分内容阅读
精原干细胞(SSCs)是雄性生殖细胞的前体细胞，具有终生扩增性和永生性，是产生雄性生殖细胞的保证，也是生殖系中唯一的在成体中还能增殖的细胞。目前，SSCs已成为发育学研究的热点之一，并在兽医临床学和转基因动物的制备方面具有广阔的应用前景。本研究分离提取了孵化至第19d的鸡胚睾丸中SSCs进行冷冻保存和体外培养，以期筛选出适合鸡胚SSCs冷冻保存的适宜的冷冻保护剂及其浓度；同时进行了体内鸡SSCs转染外源基因(pEGFP-N1)的探索，观察了转染后外源基因在精子、种蛋胚盘及不同孵化日龄胚胎及其组织器官中的表达，为以后利用SSCs生产转基因鸡的研究奠定基础。研究结果可归纳为以下几个方面：
1.本研究采用二酶三步法获取孵化第19d的鸡胚SSCs，分别单独采用浓度为5％、10％、15％的二甲基亚砜(DMSO)、乙二醇(EG)、甘油作为冷冻保护剂进行超低温冷冻保存，复苏后台盼兰染色检查细胞存活率，比较不同浓度的各种冷冻保护剂对鸡胚SSCs的冷冻保存效果；并在添加细胞因子的体外培养体系中，观察复苏后SSCs存活和增殖。结果显示：(1)当DMSO的浓度为5％、10％及15％时，复苏后细胞存活率分别为73.1％、88.6％和74.8％，三者差异显著；当乙二醇浓度为5％、10％和15％时，复苏后细胞存活率分别为69.4％、83.1％和65.2％，三者差异显著；当甘油浓度为5％、10％、15％时，复苏后细胞存活率均小于15％，三者差异不显著。(2)以10％DMSO为冷冻保护剂进行冷冻保存的SSCs，复苏后接种在以鸡胚胎成纤维细胞为饲养层的培养体系中进行体外培养，发现复苏后生长良好并聚集成集落，AKP染色呈阳性反应，在无饲养层的培养体系中没有集落生成；而以5％和15％的DMSO为冷冻保护剂的SSCs，无论饲养层存在与否均无集落生成；以5％、10％、15％乙二醇为冷冻保护剂时，复苏后无论饲养层存在与否，SSCs均能增殖，但未有AKP阳性集落生成；以5％、10％、15％的甘油为冷冻保护剂时，复苏后的SSCs存活时间极短，只能存活12h左右。比较不同冷冻保护剂对SSCs的冷冻效果，结果显示：10％DMSO对鸡胚SSCs的冷冻保存效果最佳，复苏后细胞的存活率及增殖能力显著高于乙二醇和甘油在不同浓度下的保存效果。
2.以增强型绿色荧光蛋白基因(pEGFP-N1)为目的基因，直接将pEGFP-N1通过随机打点法注射入睾丸，转染SSCs，产生携带有pEGFP-N1的成熟精子用于生产转基因鸡。比较了注射不同剂量的外源基因时，公鸡产生携带有外源基因精子的比率，并以转染率最高的公鸡为种公鸡，进行人工采精、授精，产生下一代，结果：
(1)当pEGFP-N1的注射量为50μg、100μg、150μg和200μg时，48h后取出睾丸经二酶三步法分别提取组织、分离细胞并进行涂片检测，在荧光显微镜下均可见绿色荧光表达，其比率分别为4.0％、8.7％、10.2％和13.6％，四者之间差异显著。(2)分别采用50μg、100μg、150μg和200μg剂量的pEGFP-N1注射公鸡睾丸，并在术后的不同时段对公鸡进行精液检测。实验结果显示：在术后第25d，精子中绿色荧光表达率为分别为2.2％、2.3％、2.1％和2.2％，四者差异不显著；在术后第32d，精子中绿色荧光表达率分别为6.7％、7.9％、8.7％和9.0％。术后39d～160d，每次在同一时间检测，随着注射剂量的增加，精子中绿色荧光的表达率也随之提高。(3)注射pEGFP-N1后，精子中绿色荧光的表达率随时间的推移逐渐提高，在注射后第70d～160d之间表达率趋于稳定：在注射剂量为50μg的公鸡精子中pEGFP-N1的表达率为12.2％～12.7％；注射剂量为100μg时表达率为12.1％～12.8％；注射剂量为150μg时表达率为15.6％～15.9％；注射剂量为200μg时表达率为18.7％～19.1％。(4)对注射200μgpEGFP-N1的公鸡进行人工采精、授精，检测受精蛋中胚盘的荧光表达率，在73.08％的胚盘中观察到表达绿色荧光。在孵化不同时期，取不同鸡胚胎的心、肝、肾、性腺四种组织器官及全胚进行荧光检测，绿色荧光阳性率在50.00％～66.67％之间；提取四种组织器官及全胚DNA进行PCR检测，阳性率为55.57％～69.23％。实验结果表明，利用SSCs介导生产转基因鸡是切实可行的。