【摘 要】
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本研究以不同品种、不同发育阶段的蓝莓果实为试验材料,首先采用代谢组对其不同发育阶段的花色苷单体种类、单体相对含量及差异代谢物进行分析;其次,采用转录组对蓝莓花色苷生物合成通路的相关基因进行分析,筛选出成熟期‘密斯提’蓝莓作为原料;再次,通过对‘密斯提’蓝莓中花色苷提取及纯化条件进行优化,得到高纯度的矢车菊素-3-O-葡萄糖苷单体;最后,探究矢车菊素-3-O-葡萄糖苷单体对Aβ1-42诱导人神经母细
【基金项目】
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贵州省农产品产地初加工关键技术研发与应用科技创新基地（黔科中引地[2020]4018号）；
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本研究以不同品种、不同发育阶段的蓝莓果实为试验材料,首先采用代谢组对其不同发育阶段的花色苷单体种类、单体相对含量及差异代谢物进行分析;其次,采用转录组对蓝莓花色苷生物合成通路的相关基因进行分析,筛选出成熟期‘密斯提’蓝莓作为原料;再次,通过对‘密斯提’蓝莓中花色苷提取及纯化条件进行优化,得到高纯度的矢车菊素-3-O-葡萄糖苷单体;最后,探究矢车菊素-3-O-葡萄糖苷单体对Aβ1-42诱导人神经母细胞瘤细胞（SH-SY5Y）产生的细胞凋亡的预防及治疗机制。主要研究结果如下:（1）分析了‘莱克西’、‘密斯提’、‘灿烂’和‘圆蓝’四个品种蓝莓果实不同发育阶段花色苷单体种类和单体相对含量变化,及花色苷生物合成途径上F3H、F3’H、DFR、F3’5’H、ANS、UFGT和FLS基因的差异表达。结果表明:首次在该四个蓝莓品种中检测出了32种花色苷单体,包括矢车菊花青素、飞燕草花青素、锦葵花青素、天竺葵花青素、芍药花花青素和矮牵牛花花青素6大类,此外,还检测出6种原花青素及3种二氢黄酮醇;差异代谢物研究表明,随着果实发育,除‘灿烂’和‘圆蓝’幼果至转色期阶段外,绝大多数差异代谢物均呈现上调趋势,不同品种、同一时期间代谢物差异明显,但总体来说,四个蓝莓品种中绝大多数花色苷单体相对含量均呈现上升趋势,且在成熟期达到最高值,原花青素和二氢黄酮醇相对含量不断减少;q RT-PCR结果发现,虽然7个与花色苷生物合成途径相关基因在四个品种蓝莓发育过程中的表达存在差异,但与其花色苷的变化情况具有较高一致性;结果还表明:‘密斯提’蓝莓成熟期果实中矢车菊素-3-O-葡萄糖苷的含量最高。（2）以‘密斯提’成熟期蓝莓果实为试材,通过Plackett-Burman分析和Box-Behken响应曲面设计对超声波-微波辅助提取蓝莓花色苷工艺开展条件优化,结果表明,采用此方法提取‘密斯提’蓝莓花色苷的最佳条件为:微波功率185W、超声波功率250 W、提取温度42℃,提取时间42 min、提取次数1次和液料比25∶1,该条件下花色苷提取量为241.87 mg/100 g;采用柱层析法先对花色苷粗提物进行初步纯化,结果表明:AB-8大孔树脂效果最好,最佳条件吸附平衡时间2 h、解吸平衡时间2 h、稀释倍数4倍、60%体积分数乙醇作为洗脱剂、上样流速4 r/min、上样量9、洗脱流速4 r/min、蒸馏水量为2.5 BV,在此条件下,采用p H示差法测定花色苷纯度为75.21%;通过高效液相制备色谱进行进一步纯化,得到纯度为93.73%的矢车菊素-3-O-葡萄糖苷单体;通过DPPH、ABTS、羟自由基和FRAP法测定蓝莓果汁、蓝莓花色苷粗提物、大孔树脂纯化后的花色苷和高效液相制备色谱纯化后的花色苷抗氧化性,结果表明,花色苷的抗氧化性具有纯度依赖性。（3）采用Aβ1-42诱导人神经母细胞瘤细胞（SH-SY5Y）损伤构建阿尔兹海默症细胞模型。以矢车菊素-3-O-葡萄糖苷单体为对象,探究其通过调节Ca2+介导的线粒体功能障碍对阿尔兹海默症细胞凋亡的保护机理的研究。结果表明:矢车菊-3-O-葡萄糖苷能够下调cytochrome C、caspase 9、caspase 3、cleaved caspase 3等一系列基因及其对应蛋白的相对表达量,从而避免细胞凋亡现象。除此之外,促凋亡蛋白bax基因及蛋白相对表达量的下调及抗凋亡蛋白bcl-2基因及蛋白相对表达量的上调,可以从源头上减少和减缓线粒体Ca2+通道的形成及加剧,调节细胞质内Ca2+含量,从而减少自由基的产生和ATP的下降,维持线粒体的正常功能,最终避免细胞凋亡现象的发生。综上所述,说明矢车菊素-3-O-葡萄糖苷能够在一定程度上有效地预防和治疗由Aβ1-42诱导SH-SY5Y细胞产生的凋亡,并且这种预防保护作用与矢车菊素-3-O-葡萄糖的剂量有一定的依赖性,当矢车菊-3-O-葡萄糖苷含量为60μg/m L时保护效果最好。此外,相比于矢车菊素-3-O-葡萄糖对Aβ1-42诱导SH-SY5Y细胞产生的凋亡的治疗作用,矢车菊素-3-O-葡萄糖的预防的效果明显要更好。
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