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研究背景:心肌缺血再灌注损伤以及不同病因导致的慢性心衰是危害人类健康的重要疾病1.2。缺血缺氧的心肌在被恢复血流灌注后,心肌损伤未减轻反而进一步加重在心肌结构、功能和代谢等方面损伤的现象被称为心肌缺血再灌注(ischemia/reperfusion,I/R)损伤3。心衰往往由各种疾病引起心肌收缩能力减弱,从而使心脏的血液输出景减少,不足以满足机体的需要,并由此产生一系列症状和体征4.5。本课题重点研究肿瘤坏死因子α诱导蛋白 8样蛋白2(TIPE2)6在心肌缺血再灌注损伤及慢性心衰模型中的作用并进一步探讨 TIPE2的表达调控机制以及以TIPE2为靶点干预的治疗作用。肿瘤坏死因子α诱导蛋白8样蛋白2(TIPE2)是在研究小鼠的自身反应性脑脊髓炎(EAE)时被新发现的免疫负调节因子,属于TNFAIP8家族,正常情况下主要表达于髓系及淋巴系免疫细胞,尤其是T淋巴细胞、单核细胞或者巨噬细胞,具有独特的死亡效应结构域(DED),其缺失会引起严重的炎症性疾病,在维持机体的免疫稳态方面发挥着重要作用。研究人员发现,TIPE2可以识别含有半胱天冬酶8的信号复合体,从而负性调控T细胞受体(TCR)和Toll样受体(TLR)通路起到抗炎作用7。TIPE2敲除后的细胞对TCR和TLR高反应,并且生成的炎症因子显著增加。在人类,TIPE2异常表达与全身免疫性疾病、糖尿病肾病及乙型肝炎有关。我们研究发现TIPE2与心肌细胞自噬水平的调控有关,并且TIPE2可抑制模式识别受体NOD2介导的炎症反应,明确TIPE2在心肌细胞中的作用及机制,阐明TIPE2及NOD2之间的相互作用能够为为心脏疾病的治疗提供理论依据及实验基础。研究目的:一、在心肌缺血再灌注损伤动物模型中检测TIPE2的表达变化。二、探讨TIPE2是否在心肌细胞及心脏成纤维细胞中表达;在缺氧/复氧病理条件下体外培养巨噬细胞中TIPE2的表达情况。三、探讨TIPE2在心肌细胞缺血再灌注损伤中的作用机制,明确TIPE2与心肌细胞自噬及凋亡的关系。四、明确TIPE2在心肌缺血再灌注损伤中抑制炎症反应的作用机制。探讨TIPE2与模式识别受体NOD2的关系。五、明确慢性心衰中TIPE2的表达变化及分子调控机制六、验证以TIPE2为靶点进行的基因治疗的作用研究方法:体外实验研究:1.我们体外实验培育了心肌细胞、巨噬细胞等,通过蛋白印迹(Western blot,WB)检测在缺氧/复氧(I/R)条件下心肌细胞、巨噬细胞中是TIPE2的表达及变化;2.通过基因芯片检测TIPE2过表达对心肌细胞I/R损伤的保护作用及下游分子机制,明确TIPE2对心肌细胞自噬、凋亡等的影响,确TIPE2抑制心肌缺血炎症反应的作用机制;3.以巨噬细胞为工具细胞,探讨TIPE2与模式识别受体NOD2的关系,通过免疫共沉淀进一步证实NOD2与TIPE2之间的关系。MDP刺激巨噬细胞及中性粒细胞,通过免疫荧光、WB及Real time PCR检测I/R条件下NOD2及TIPE2表达水平,给予shRNA-NOD2转染后检测NOD2及TIPE2表达的变化情况。MDP预处理巨噬细胞,MAPKs信号通路以及NF-κB信号通路活化水平被通过检测ERK1/2、p38、JNK、IκBα及p65的磷酸化水平来估测,进一步给予pRK5-TIPE2转染后ERK1/2、p38、JNK、IκBα及p65的磷酸化的影响。体内(动物学)实验研究:1.在C57BL/6J野生型小鼠分别随机分成假手术对照组及手术组。通过结扎小鼠冠状动脉左前降支30min,然后再灌注不同的时间在建立心肌缺血再灌注(I/R)损伤模型。实时荧光定量PCR检测和Western Blot分析TIPE2的表达变化。2.NOD2敲除小鼠为工具鼠构建心肌I/R损伤模型通过WB分析TNFAIP8家族在心肌I/R损伤中表达水平。3.使用阿霉素诱导慢性心衰模型,WB表征TIPE2的表达变化及TIPE2的表达调控机制。4.慢病毒介导的基因转染方式在小鼠体内抑制或者过表达TIPE2,明确以TIPE2为靶点的治疗在心肌缺血中的作用。用pGLV3-shRNA2-TIPE2转染NOD2-/-小鼠,使TIPE2沉默,通过免疫免疫荧光技术确定转染效率,小动物超声心动图检测心肌I/R损伤的小鼠左心室内径及心功能,EB和TTC染色区分心肌梗死危险区范围及梗死区范围;ELISA测定组织的炎症细胞因子水平。最后通过LV-TIPE2转染小鼠,通过超声心动图、EB和TTC染色及ELISA检测TIPE2过表达后对心功能、心肌梗死危险区范围及梗死区范围和炎症细胞因子水平的影响。结果:1.TIPE2在心肌缺血再灌注损伤中表达上调。2.TIPE2可抑制心肌细胞中缺血再灌注诱导的自噬水平上调,从而抑制心肌细胞凋亡。3.NOD2负调控巨噬细胞TIPE2的表达,可以通过改变TIPE2影响NF-κB信号通路介导的炎症反应发挥保护作用。。4.TIPE2在慢性心衰模型中水平下调,进一步验证其在心肌细胞的损伤过程中发挥保护作用,同时结果显示,TIPE2的表达受到SIRT6的调控。5.慢病毒介导的TIPE2基因过表达可缓解心肌缺血再灌注损伤。结论:TIPE2可通过抑制心肌细胞自噬水平发挥对心肌缺血再灌注损伤的保护作用,同时TIPE2在慢性心衰过程中表达降低,并且SIRT6参与到TIPE2表达的调控,以TIPE2为靶点的基因治疗可改善心肌缺血再灌注损伤。创新性:本课题首次发现NOD2负调控巨噬细胞TIPE2的表达,可以通过改变TIPE2影响NF-κB信号通路介导的炎症反应发挥保护作用。TIPE2可以抑制通过NOD2信号通路及自噬水平起到心肌缺血再灌注的保护作用。首次明确慢性心衰过程中TIPE2表达降低并且SIRT6参与到TIPE2的表达调控。慢病毒介导的TIPE2基因过表达技术进一步证TIPE2能够作为干预靶点对心肌缺血再灌注损伤进行治疗,为多种心脏疾病的治疗提供新的靶点及理论依据。