白芍总苷（Total glucosides of paeony，TGP），是从传统临床常用中药白芍中提取的有效部位。芍药苷（Paeoniflorin，Pae）和芍药内酯苷（Albiflorin，Alb）是其主要的有效成分，在白芍总苷中含量最高。研究表明TGP具有明显的保肝、抗炎和免疫调节作用，对急、慢性化学性和免疫性肝损伤均有防治作用，有望成为保肝良药，但是其作用机理尚不清楚，因此有必要研究白芍总苷的保肝机理。课题组前期对白芍总苷在急性CCL4肝损伤大鼠模型、免疫性肝损伤大鼠模型的药代动力学方面进行了系统研究，发现其吸收较少，生物利用度较低。推测在体内发挥药效作用可能是白芍总苷代谢物，因此有必要研究白芍总苷的代谢。本研究拟基于代谢组学方法寻找四氯化碳诱导急性肝损伤大鼠模型的标志性差异代谢物，在此基础上研究白芍总苷对其的调控作用，从而阐释其保肝机理；拟基于液质联用技术，采用体内的方法研究白芍总苷的代谢。第一部分白芍总苷基于代谢组学的保肝机理研究目的：利用LC-MS技术基于代谢组学思路同步并行分析四氯化碳诱导急性肝损伤大鼠模型血浆和尿液，寻找差异性代谢物。在此基础上，进一步分析白芍总苷干预后，对差异代谢物的调控，阐释白芍总苷的保肝作用机制。方法：1动物和分组健康wistar大鼠40只，♂，体重为240～280g。按体重随机分为4组：正常对照组、正常动物TGP给药组、模型对照组和模型动物TGP给药组。正常对照组和模型对照组灌胃给予纯化水，给药组分别灌胃给予TGP。给药剂量：1.41g/kg，给药时间：14天。2生物样品采集模型动物末次给药后2h，腹腔注射50%CCl4玉米油,10ml/kg（CCL4：玉米油=1:1）。每组尿液大鼠代谢笼中收集尿液；每组血浆大鼠断头取血，分为两份血液分别处理得血浆和血清，置-80℃保存，备用。取肝左叶10%甲醛固定常规石腊包埋，HE染色。3样品预处理血浆，利用有机溶剂对血浆进行蛋白沉淀，涡旋，离心，取上清液，乙腈水3:1定溶至1mL，离心。尿液涡旋离心，乙腈与尿液1:1沉淀蛋白，涡旋离心，取上清液，乙腈水3:1定溶至1mL，涡旋混匀，离心。4色谱质谱条件利用ULTRIP LC-100和AB SCIEX Q-Triple4500System采集数据。5数据处理通过被测样本的正、负离子检测模式的Q-Triple4500MS谱测定得原始数据，利用AB公司的markerview1.2.1代谢组学分析软件将数据转换为二维数据阵。通过软件SIMCA-P进行了多变量统计分析，PCA（PrincipalComponent Analysis）主成分分析、偏最小二乘判别分析PLS-DA（Partialleast-Discriminant Analysis, PLS-DA）和正交偏最小二乘判别分析OPLS-DA（Orthogonal Partial least-Discriminant Analysis, OPLS-DA）。结合AB公司的shortcut to markerview1.2.1代谢组学分析软件的t检验，分析标志性代谢物的组间差异。6差异代谢物的鉴别通过代谢物或化合物的数据库HMDL、Massblank查找可能的代谢物。结合质谱裂解规律解析可能代谢物的结构，从而推测确定可能的代谢物。结果：生化检测和病理组织学观察结果表明造模成功，白芍总苷能防治四氯化碳诱导大鼠的肝损伤。通过代谢组学分析血浆中鉴定3个差异性代谢物，为丙氨酸、甘氨酸和脯氨酸；尿液中9个代谢物，为丙氨酸、甘氨酸、脯氨酸、谷氨酰胺以及有机酸类己酸、苯乙酸、2-丙烯酸、对羟基苯乙烯酸和3,4-二羟基苯丙酸。其中甘氨酸在血和尿液中均呈下降趋势，尿液中的苯乙酸也为下降趋势，其余均上升。TGP给药组与空白对照组没有明显差异，说明药物本身没有影响。模型TGP给药组回调丙氨酸、甘氨酸和脯氨酸的水平，其他差异性代谢物变化不明显。结论：基于LC-MS液质联用技术的代谢组学方法，通过多变量统计分析能够完全区分正常对照、模型对照组和模型动物TGP给药组样本，表明其有明显差异性；正常动物TGP给药组与正常对照组区分不明显，说明TGP药物本身对动物的影响不明显，不是造成正常对照、模型对照组和模型动物TGP给药组的差异性原因。并且与传统药理学的生化检测和病理组织结果一致。通过分析正常动物和造模24小时内动物的血浆和尿液的差异性代谢物，丙氨酸、脯氨酸、甘氨酸和谷氨酰胺水平异常，提示CCL4诱导急性肝损伤大鼠模型可能造成氨基酸代谢异常。有机酸类己酸、苯乙酸、2-丙烯酸、对羟基苯乙烯酸和3,4-二羟基苯丙酸与肠道菌群的密切相关，因此肠道菌群也可能发生变化。首次基于代谢组学方法分析白芍总苷干预CCL4诱导急性肝损伤大鼠模型后血浆和尿液的代谢物变化，检测到丙氨酸、脯氨酸和甘氨酸水平的回调，提示白芍总苷对CCL4诱导急性肝损伤大鼠模型有预防性保护作用。丙氨酸和脯氨酸的回调，推测TGP的调控可能与三羧酸循环有关。甘氨酸的回调说明TGP的调控可能与消除氧自由基的谷胱甘肽的合成有关。对其他差异性代谢物无明显的调控。第二部分白芍总苷的体内代谢研究目的：本研究利用UPLC-Q-TOF-MS技术测定芍药苷、芍药内酯苷单体和白芍总苷在大鼠体内的代谢物，并比较芍药苷和芍药内酯苷在单体状态和以白芍总苷有效部位形式给药的代谢区别，明确白芍总苷体内的代谢物和代谢途径，阐释其代谢特点。方法：1动物和分组健康Wistar大鼠60只，♂，体重为240～280g，分为4组：正常对照组、芍药苷给药组、芍药内酯苷给药组、白芍总苷给药组。正常对照组给予1ml/100g的水，其他给药组给予各受试物5mg/kg。2生物样品采集在代谢笼中收集尿液，总胆管插管采集胆汁，眼眶静脉丛取血，肝素钠抗凝，-80℃保存，备用。3样品预处理尿液和胆汁使用固相萃取小柱（SPE，Waters Sep-PakRVac3cc,200mgC18Cartridges）萃取富集。血浆在4℃环境复溶，3:1甲醇水对血浆进行蛋白沉淀，氮气吹干，甲醇复溶。5色谱质谱条件采用质量亏损技术，利用AB SCIEX TripleTOFTM5600System联用采集数据。6数据处理根据对照品和血浆、胆汁和尿液中原形药物质谱，总结区分芍药苷和芍药内酯苷质谱裂解规律。利用代谢途径通过Metabolit1.5.1软件多种方法寻找代谢物。结果：通过分析，在体内芍药苷和芍药内酯苷代谢以水解、氧化和葡萄糖结合、葡醛酸结合反应为主。芍药苷单体给予大鼠后，在大鼠体内发现10个代谢物，其中4个已知代谢物：芍药苷代谢素Ⅰ的两个构型、芍药苷代谢素Ⅱ和去苯甲酰基芍药苷；6个未知代谢物：芍药苷结合葡萄糖C29H38O16，氧化芍药苷C23H28O12，脱水去苯甲酰基芍药苷C16H22O9，甲基化去苯甲酰基芍药苷的两个异构体C17H26O10，甲基化去苯甲酰基芍药苷脱水产物C17H26O9。芍药内酯苷单体给予大鼠后，在大鼠体内发现14个代谢物，4个已知代谢物：芍药苷代谢素Ⅰ的两个构型、芍药苷代谢素Ⅱ和去苯甲酰基芍药苷；10个未知代谢物：氧化芍药苷C23H28O12，脱水去苯甲酰基芍药苷C16H22O9，甲基化去苯甲酰基芍药苷的两个异构体C17H26O10，甲基化去苯甲酰基芍药苷脱水产物C17H26O9，芍药苷C23H28O11，加氢芍药内酯苷内酯C23H30O11，蒎烷基本结构的甲基化代谢物C11H16O4的两个异构体。白芍总苷给予大鼠后，在大鼠体内发现17个代谢物，4个已知的代谢物：芍药苷代谢素Ⅰ的两个构型、芍药苷代谢素Ⅱ和去苯甲酰基芍药苷；13个未知代谢物：氧化芍药苷C23H28O12，二氧化芍药苷C23H28O13，三氧化芍药苷C23H28O14，脱水去苯甲酰基芍药苷C16H22O9，甲基化去苯甲酰基芍药苷的两个异构体C17H26O10，甲基化去苯甲酰基芍药苷脱水产物C17H26O9，芍药苷C23H28O11，加氢芍药内酯苷内酯C23H30O11，芍药苷结合葡萄糖C29H38O16，芍药内酯苷结合葡萄糖C29H38O16，芍药苷结合葡醛酸C29H36O17，芍药内酯苷结合葡醛酸C29H36O17。结论：本研究利用UFLC-Q-TOF-MS/MS技术分析了白芍总苷、芍药苷和芍药内酯苷在大鼠体内的代谢物。分析测定了芍药苷单体在大鼠体内的10个代谢物，新发现6个代谢物。分析测定了芍药内酯苷在大鼠体内的14种代谢物，新发现10个代谢物。分析测定了白芍总苷在大鼠体内的17个代谢物，新发现13个代谢物。结果提示主要发生了水解反应、氧化反应和结合反应，代谢位点主要为糖苷键、酯键、苯环；芍药苷和芍药内酯苷单体给药与白芍总苷状态给药时，代谢物和代谢途径都有所不同，胆汁中白芍总苷的代谢物明显多于单体状态，但是血浆中仅有原型吸收。