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本文利用本实验室自行筛选的角蛋白高效降解菌株——地衣芽孢杆菌NJU-1411-1为研究菌株,采用固体发酵体系,系统研究了3种外源含硫化合物添加前后,相关生化指标及9种含硫化合物的含量变化。研究结果为进一步利用生物技术开发羽毛角蛋白资源、了解羽毛角蛋白生化降解机制奠定了理论基础。 1、NJU-1411-1固体发酵羽毛角蛋白,第1天为菌体生长对数期。2-5天为菌体生长的稳定期,发酵5天后菌体生长进入衰退期。NJU-1411-1产生的角蛋白酶极可能为一种诱导酶,在NJU-1411-1对数期迅速生成,在稳定期开始减少。角蛋白酶在NJU-1411-1生物降解羽毛过程中发挥关键作用,硫解作用、转脱氨基作用等起辅助作用。 2、发酵产品的可溶性蛋白含量不断提高,得率不断下降,尤其在1-3天,变化幅度最为明显。发酵瓶口始终可以检测到NH3的存在,并在第3天达到最多,表明在菌体生长稳定期,转氨基、脱氨基作用最为活跃。NH3的产生导致发酵体系pH值逐渐升高,呈弱碱性。 3、高温灭菌处理后,在羽毛浸提液中检测到了6种含硫化合物及可溶性蛋白,表明羽毛降解在灭菌时已经启动。接种NJU-1411-1后,在发酵物中检测到了7类含硫化合物:硫酸盐、硫代硫酸盐、二硫键化合物、巯基化合物、S-磺酸半胱氨酸类物质、亚硫酸盐、游离半胱氨酸,未检测到硫化物、游离的胱氨酸。含量最高的是硫酸盐、硫代硫酸盐,为NJU-1411-1发酵终产物。S-磺酸半胱氨酸类物质、亚硫酸盐的存在,证明了羽毛降解存在硫解作用,且在生长衰退期,硫解作用有所减弱。没有检测到游离胱氨酸存在,推测NJU-1411-1的硫解作用及角蛋白酶解的作用位点,更倾向于分子量小的二硫键结构(如胱氨酸)。没有检测到硫离子的存在,推测其迅速转化为H2S参与到亚硫酸盐转变为硫代硫酸盐的过程,或直接释放到空气中。 4、研究了添加10μmol/ml、50μmol/ml、250μmol/ml亚硫酸钠、硫代硫酸钠、DTT后,对发酵生化指标的影响,结果如下: (1)只有添加10μmol/ml的亚硫酸钠、硫代硫酸钠,生物量比对照稍有提高。其他浓度的添加组生物量均低于对照,但差值没有超过一个数量级。(2)所有添加组的酶活均高于对照,第3天时,添加50μmol/ml硫代硫酸钠的酶活最高,为780U/g,是对照的1.8倍。第5天时,添加250μmol/mlDTT的酶活最高,打到724.4 U/g,是对照的2.8倍。(3)添加10μmol/ml、50μmol/ml、250μmol/ml的亚硫酸钠,10μmol/ml、50μmol/mlDTT和10μmol/ml的硫代硫酸钠,可以明显提高发酵产物的可溶性蛋白含量。推测可能原因为3种含硫化合物既提高了角蛋白酶活,又依靠自身还原性,打开了羽毛角蛋白的二硫键结构,提高羽毛角蛋白的降解率、可溶性角蛋白含量。 5、研究了添加10μmol/ml、50μmol/ml、250μmol/ml亚硫酸钠、硫代硫酸钠、DTT后,对9种含硫化合物含量的影响,结果如下: (1)添加亚硫酸钠、硫代硫酸钠、DTT均显著提高了发酵产物硫酸盐和硫代硫酸盐的含量。(2)添加亚硫酸钠,可以显著提高S-磺酸半胱氨酸类物质含量,证明亚硫酸盐参与了硫解作用。而硫代硫酸钠、DTT可能并不参与到硫解作用中,但和硫解作用类似的是,可以还原角蛋白分子外围的二硫键结构,使羽毛角蛋白暴露出更多的硫解作用位点,适当提高了S-磺酸半胱氨酸含量。(3)添加50μmol/ml、250μmol/ml亚硫酸钠、硫代硫酸钠、DTT后,发酵产物中二硫键物质含量、亚硫酸盐含量明显低于对照,巯基化合物含量明显提高。推测加入了浓度高的3种含硫化合物后,角蛋白酶活、二硫键还原、硫解作用(亚硫酸盐参与)等增强,导致更多二硫键物质被还原为巯基化合物。 6、综合实验结果表明,表明50μmol/ml亚硫酸钠的添加,既可以较大程度地提高硫解作用,提高角蛋白酶活力,综合提高NJU-1411-1降解羽毛能力。