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目的:初步探讨喉癌细胞中整合素α5(ITGA5)在肿瘤细胞促进淋巴管生成继而反馈性影响肿瘤细胞生物活性的作用,为将抗淋巴管生成运用于喉癌治疗提供一定的实验依据。方法:1.通过UALCAN网站分析获取ITGA5在头颈部鳞状细胞癌(HNSC)组织中表达情况,并运用KMplot和GEPIA网站分析HNSC组织中ITGA5表达水平与患者预后的关系。2.收集80例初诊喉癌患者的肿瘤组织存档蜡块与临床病理资料,采用免疫组织化学法(IHC)检测喉癌组织中ITGA5和血管内皮生长因子-C(VEGF-C)的表达,并运用淋巴管内皮细胞(LECs)特异性标记物D2-40标记LECs,计数喉癌组织淋巴管密度(LVD);统计分析喉癌组织ITGA5表达和临床病理特征的相关性,及其与喉癌组织VEGF-C表达、LVD的关联。3.运用Hep-2和TU212喉癌细胞株体外转染si-ITGA5。ELISA检测细胞分泌的VEGF-C水平,RT-q PCR和Western bolt检测VEGF-C表达水平。4.为了分析喉癌细胞中ITGA5促进淋巴管生成的作用,将喉癌细胞株与人淋巴管内皮细胞(HLECs)建立transwell(0.4μm)共培养体系,设置Mono组(单独HLECs培养组)、Con组(野生型Hep-2/TU212+HLECs)、NC组(si-NC Hep-2/TU212+HLECs)、si-ITGA5组(si-ITGA5 Hep-2/TU212+HLECs);为进一步分析喉癌细胞中ITGA5是否通过促进其自身分泌VEGF-C影响HLECs成管率,向共培养体系喉癌细胞中加入外源性VEGF-C(5ng/m L)进行挽救实验,因此,同时设置si-ITGA5+VEGF-C组(si-ITGA5 Hep-2/TU212+HLECs+VEGF-C),检测各组的HLECs成管率。5.为了验证喉癌细胞中ITGA5通过诱导淋巴管生成进而促进喉癌细胞侵袭迁移,将转染不同si RNA的喉癌细胞株与HLECS建立transwell(8μm)共培养体系,设置Mono组(单独Hep-2/TU212培养组)、Con组(野生型Hep-2/TU212+HLECs)、NC组(si-NC Hep-2/TU212+HLECs)、si-ITGA5组(si-ITGA5 Hep-2/TU212+HLECs);同时设置si-ITGA5+VEGF-C组(si-ITGA5 Hep-2/TU212+HLECs+VEGF-C),即向共培养体系HLECS中加入外源性VEGF-C模拟淋巴管生成的微环境。Transwell侵袭迁移实验分别检测各组喉癌细胞的侵袭和迁移能力。6.统计分析方法。临床病理特征与免疫组化结果运用卡方检验或Fisher’s精确检验、Mann-Whitney检验和Spearman秩相关检验;体外细胞实验独立重复3次,实验数据均以(?)±s表示,不同实验组之间的比较采用单因素方差分析(ANOVA),P<0.05差异具有统计学意义。结果:1.通过UALCAN网站对TCGA数据库中HNSC组织(44例癌旁组织和520例癌组织)ITGA5表达水平数据进行生物信息学分析,结果显示ITGA5在HNSC组织中的表达水平明显高于癌旁组织(P<0.001);运用KMplot和GEPIA网站,对可获得的HNSC患者临床资料进行分析,结果均显示HNSC组织中ITGA5高表达患者总体生存时间比低表达患者短(P<0.01)。2.IHC结果显示80例喉癌组织中,ITGA5阳性表达定位于细胞膜和(或)细胞质,高表达率为65.0%(52/80),低表达率为35.0%(28/80);ITGA5高表达与淋巴结转移和T分期明显相关,差异具有统计学意义(P<0.05)。VEGF-C阳性表达主要定位于细胞质,高表达率为62.5%(50/80),低表达率为37.5%(30/80);VEGF-C高表达与淋巴结转移和肿瘤大小显著相关(P<0.01),而与其它的临床病理参数均无明显相关性。80例喉癌组织的LVD中位数为3.0(2.0,6.0);将LVD<3分为低密度组,LVD≥3分为高密度组;高密度率为58.8%(47/80);低密度率为41.2%(33/80);LVD与淋巴结转移和肿瘤部位明显相关(P<0.05),而与其它的临床病理参数均无明显相关性。统计结果还表明ITGA5高表达组LVD显著高于低表达组(P<0.05);ITGA5表达水平与VEGF-C表达水平呈显著正相关(r=0.677,P<0.001)。3.ELISA结果显示,ITGA5敲减的喉癌细胞株中的VEGF-C分泌水平明显减少;RT-q PCR和Western bolt结果显示下调喉癌细胞ITGA5的表达,可导致喉癌细胞株中VEGF-C表达水平显著降低。4.成管实验检测HLECs的成管能力,结果发现,与单独HLECs培养成管率相比,和喉癌细胞株共培养后的HLECs成管率明显增加;与和转染si-NC的喉癌细胞共培养后的HLECs相比,和转染si-ITGA5的喉癌细胞共培养后的HLECs成管率明显减少,加入外源性VEGF-C可部分逆转敲减喉癌细胞ITGA5对HLECs成管率的影响。5.Transwell实验检测与HLECs共培养的喉癌细胞侵袭迁移能力,结果显示,与HLECs共培养后喉癌细胞的侵袭迁移能力显著增强;下调喉癌细胞中ITGA5表达可显著降低共培养后喉癌细胞的侵袭迁移能力;与转染si-ITGA5喉癌细胞共培养的HLECS中加入外源性VEGF-C,以模拟淋巴管生成的微环境后,又可明显增强共培养体系中喉癌细胞侵袭迁移能力。结论:喉癌细胞中ITGA5可通过促进自身VEGF-C分泌,增强其促淋巴管生成作用,并反馈性增强喉癌细胞迁移和侵袭能力。