研究背景慢性阻塞性肺疾病是一种进展性致残性疾病,在有害因素的刺激下,气道和肺产生异常炎症反应。COPD的主要特点是持续气流受限和不完全可逆的的气道炎症。对COPD的细胞学、分子学以及遗传学病因仍缺乏充分的了解,目前的治疗都存在其不足,不能有效延缓疾病的进展或降低死亡率。目前的研究证实,在老龄化人群中,因衰老过程加速可同时患有有多种疾病,被称为共生疾病(multimorbidity)。包括COPD、冠心病、代谢性疾病以及神经系统退变等慢性退行性疾病,他们有着共同的发病机制,与细胞的衰老加速密切相关。细胞衰老是由各种压力导致不可逆的生长停滞状态的过程。老化过程中衰老细胞积聚,导致一系列衰老相关性疾病。研究证实,细胞衰老是共生疾病的共同原因。引起细胞衰老加速的机制涉及到端粒的缩短,PI3K/AKT/mTor通路的活化,自噬受损,线粒体功能障碍,干细胞耗竭,免疫衰老等。很多这些途径由慢性氧化应激驱动。氧化应激是引起细胞衰老的重要原因。在有氧代谢过程中产生的活性氧簇(reactive oxygenspecies, ROS)对大多数细胞都具有毒性作用。在正常情况下,机体内ROS的产生和ROS清除系统处于动态平衡状态。如果ROS产生增多或/和机体清除ROS能力的下降,机体就会出现氧化应激(oxidative stress)。当机体处于氧化应激状态时,体内组织细胞ROS量相对升高,超过机体的清除能力,可导致机体组织脂质过氧化水平升高,引起DNA氧化损伤和蛋白质的表达异常,对机体造成损害。在COPD患者中,氧化应激主要来源于烟雾中的氧化剂和体内活化的炎症细胞,吸烟与ROS及氧化应激密切相关。ROS活化PI3K,通过AKT激酶活化mTor,激活PI3K/AKT/mTor通路。PI3K/AKT/mTor通路作为细胞内非常重要的信号转导途径,参与调控细胞的生长、存活、增殖、凋亡、血管生成、自吞噬等过程。在细胞的衰老过程中,该通路也起着至关重要的作用。PI3K/AKT/mTor通路活化后,通过ULK1的激活和抑制SIRT1的活性,进而加速细胞衰老。综上所述,抑制细胞衰老的加速,对COPD以及其他共生疾病有一定的治疗作用。近年来,从我国传统中草药中提取药物治疗慢性疾病已经成为当前国内中医药现代化的重要组成部分。冬虫夏草(Cordyceps sinensis),又名虫草,是麦角菌科真菌冬虫夏草寄生在蝙蝠蛾科昆虫幼虫上的子座及幼虫尸体的复合物,是世界上目前最稀有珍贵的药用真菌之一,有极高的医疗保健作用和经济价值,具有抗衰老、抗病原微生物、抗恶性肿瘤、扩张血管、改善动脉硬化症、调节内分泌、呼吸、免疫、神经系统及肾脏和肝脏等多种功效。现在对于虫草的研究主要集中在化学成分和药理作用。虫草中含有核苷、多糖、甾醇、蛋白质、氨基酸、多肽等,在抗炎、抗氧化、抗肿瘤、抗凋亡和免疫调节等方面发挥重要作用。但冬虫夏草的具体作用机制尚不清楚。有研究发现冬虫夏草可以降低人肺上皮细胞的氧化应激损伤,抗氧化是冬虫夏草的重要作用机制。呼吸系统中的氧化应激主要来源于烟雾,与细胞衰老密切相关。本实验拟研究虫草菌液对于CSE(香烟烟雾提取物,Cigarette Smoke Extract)诱发的细胞衰老的抑制作用及其机制。从细胞分子机制延缓COPD细胞的衰老,对以后COPD病人的疾病预防及治疗提供一定的价值。研究目的1.探讨CSE对人支气管上皮细胞存活率的影响。2.研究CSE诱导人支气管上皮细胞衰老。3.研究冬虫夏草菌液对于CSE诱导的细胞的衰老的抑制作用。4.研究ROS和PI3K/AKT/mTor通路在CSE诱导细胞衰老中的作用。5.探讨CSE和虫草菌液对于细胞衰老的作用机制。研究方法1.人支气管上皮细胞(16HBE)进行体外培养,用不同浓度CSE对细胞进行干预不同时间,以MTT法测定细胞存活率,测定CSE对上皮细胞存活率的影响,确定最合适干预的CSE浓度和时间。2.16HBE细胞经过上述实验确定的浓度和时间的CSE干预后,通过SA-β-gal染色法和P16、P21检测细胞衰老。通过对培养细胞进行衰老相关的β-半乳糖苷酶染色,计算视野中染色细胞的百分数,与对照组进行对比,P<0.05具有显著差异。P16和P21的检测通过免疫荧光化学技术定性,实时定量聚合酶链反应测定mRNA相对表达,以及免疫蛋白印迹法测定蛋白表达定量。同时,以梯度CSE处理细胞,免疫蛋白印迹法测定P16和P21的蛋白表达。3.在实验组进行CSE干预的两小时前加入CS(虫草菌液,Cordyceps sinensis),细胞培养后进行衰老相关指标的检测。测定β-半乳糖苷酶染色阳性细胞率,免疫荧光、实时定量聚合酶链反应、免疫蛋白印迹测定P16、P21表达。4.为测定ROS 和PI3K/AKT/mTor通路的活化,16HBE细胞经过CSE、CS处理后,通过ROS试剂盒检测ROS荧光,定性分析不同干预条件下ROS变化；通过免疫蛋白印迹测定PI3K、AKT、mTor蛋白表达以及它们的磷酸化蛋白表达；以梯度CSE处理细胞,免疫蛋白印迹法测定AKT、mTor的磷酸化蛋白表达。5.为了研究CSE和虫草菌液对于细胞衰老的作用机制,在CSE组、CS+CSE组中,我们分别加入ROS抑制剂NAC、PI3K抑制剂Ly294002,测定ROS荧光强度、PI3K/AKT/mTor以及它们的磷酸化蛋白表达,以观察加入抑制剂后对细胞通路的影响,测定β-半乳糖苷酶染色和P16、P21的蛋白表达观察对细胞衰老的影响。研究结果1.经过CSE处理后,16HBE细胞存活率被抑制,呈时间和浓度依赖性。根据MTT法绘制细胞生存率曲线,2%CSE作用24小时用于之后的干预研究。2.经过CSE处理后,16HBE细胞的衰老增强。对比对照组,SA-β-gal染色阳性细胞比率增高(p<0.05),P16和P21的免疫化学荧光增强,P16和P21的mRNA相对表达增加(分别为：p<0.05,p<0.05),P16和P21蛋白表达量增加(分别为：p<0.05,p<0.05)。P16和P21的蛋白表达量随CSE的作用浓度和作用时间而增加(分别为：p<0.05,p<0.05)。3.与CSE处理细胞组进行对比,在CSE干预前加入CS组细胞的衰老减弱。与CSE组对比,CSE+CS组的SA-β-gal染色阳性细胞比率降低(p<0.05),P16和P21的免疫化学荧光减弱,mRNA相对表达减少(分别为：p<0.05,p<0.05),蛋白表达量减少(分别为：p<0.05,p<0.05)。4.与对照组相比较,CSE组细胞ROS荧光增强,PI3K、AKT、mTor蛋白表达无差异,AKT、mTor磷酸化蛋白表达增加(分别为：p<0.05,p<0.05)。对比CSE组,预先加入CS组细胞的ROS荧光减弱,PI3K、AKT、mTor蛋白表达无差异,AKT、mTor磷酸化蛋白表达减少(分别为：p<0.05, p<0.05)。AKT、mTor磷酸化蛋白表达呈CSE浓度和时间依赖性(分别为：p<0.05,p<0.05)。5.加入ROS抑制剂NAC后,CSE组、CS+CSE组细胞的ROS荧光均呈明显减弱,AKT、mTor磷酸化蛋白表达均减少(分别为：p<0.05,p<0.05,p<0.05,p<0.05),由此,ROS和PI3K/AKT/mTor信号通路活化降低；加入NAC后,CSE组、CS+CSE组细胞衰老减弱,表现为SA-β-gal染色阳性细胞的比率均有降低(分别为：p<0.05,p<0.05)、P16和P21蛋白表达均呈下降(分别为：p<0.05,p<0.05,p<0.05,p<0.05)。加入PI3K抑制剂Ly294002后,CSE组、CS+CSE组细胞的AKT、mTor磷酸化蛋白表达明显减少(分别为：p<0.05,p<0.05,p<0.05,p<0.05),由此,信号通路活化降低,但ROS荧光变化不明显,PI3K抑制剂对ROS影响不大；加入Ly294002后,CSE组、CS+CSE组细胞衰老减弱,表现为SA-β-gal染色阳性细胞的比率均有降低(分别为：p<0.05,p<0.05)、P16和P21蛋白表达均呈下降(分别为：p<0.05,p<0.05,p<0.05,p<0.05)。研究结论1.CSE抑制人支气管上皮细胞存活率,呈时间和浓度依赖性。2.CSE可以诱导人支气管上皮细胞衰老。3.CS在体外细胞培养中能抑制CSE诱导的细胞衰老。4. ROS和 PI3K/AKT/mTor信号通路在CSE诱导的细胞衰老中起着重要的作用。5.阻断ROS/mTor信号通路可以减轻CSE诱导的细胞衰老。