论文部分内容阅读
背景:调节性T细胞(regulatory T cells,Tregs)是具有负向免疫调控作用的T淋巴细胞,在建立与维持移植耐受等方面起关键作用。但目前有关角膜移植免疫排斥过程中Tregs功能变化的规律尚不十分明确。目的:本课题主要研究角膜移植免疫排斥过程中Tregs表型及功能的变化规律,在此基础上探讨角膜移植免疫排斥微环境影响Tregs表型与功能的机制,以期为临床角膜移植免疫排斥反应的多元化防治提供理论依据。方法:(1)角膜移植免疫排斥过程中调节性T细胞数目及功能的变化通过构建小鼠穿透性角膜移植模型,在此基础上研究角膜移植免疫排斥过程中Tregs数目及功能的变化情况:(1)Tregs数目变化的检测:制备眼前节单细胞悬液,利用流式细胞术检测角膜移植免疫排斥过程中Treg细胞的相对含量;(2)Treg细胞中关键转录因子Foxp3(Forkhead box protein P3)表达水平分析:分离发生免疫排斥小鼠的眼前节组织,并通过实时荧光定量聚合酶链反应(quantitative real-time polymerase chain reaction,q RT-PCR)及流式细胞术检测角膜移植免疫排斥过程中Foxp3的表达水平;(3)Tregs免疫抑制功能评估:利用角膜移植免疫排斥小鼠的眼前节上清液模拟角膜移植免疫排斥微环境,通过Tregs与效应T细胞(effector T cells,Teffs)共培养实验,研究Treg细胞对Teffs增殖的影响,进而评估免疫排斥过程中Treg细胞功能的改变。(2)角膜移植免疫排斥微环境影响调节性T细胞功能的机制分别采用免疫磁珠法分选BALB/c小鼠脾脏中的Tregs及Teffs,然后采用Tregs与Teffs体外共培养模型,探讨角膜移植免疫排斥微环境影响Tregs功能的机制:(1)利用蛋白免疫印迹(western blot,WB)及流式细胞术检测角膜移植免疫排斥微环境对Tregs中天冬氨酸特异酶切的半胱氨酸蛋白酶-8(cysteine-dependent aspartyl-specific protease-8,caspase-8)及Foxp3表达水平的影响;(2)利用小分子化合物抑制caspase-8活性,通过体外共培养实验研究Tregs对Teffs增殖的影响,进而评估caspase-8对Tregs免疫抑制功能的影响;(3)利用WB分析抑制caspase-8活性后Treg细胞中Foxp3的表达水平。(3)肿瘤坏死因子-α中和性抗体对角膜移植免疫排斥过程中Foxp3及caspase-8表达的影响构建小鼠穿透性角膜移植模型,并通过结膜下注射肿瘤坏死因子-α(tumour necrosis factor-α,TNF-α)中和性抗体评估其对角膜移植免疫排斥反应的影响:(1)裂隙灯显微镜观察角膜植片透明情况,记录角膜植片生存时间并采用Kaplan-Meier方法绘制角膜生存曲线;(2)利用免疫荧光、酶联免疫吸附测定(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)及q RT-PCR评估角膜植片的病理改变情况;(3)采用WB分析干预治疗后角膜植片中Foxp3及caspase-8表达水平的变化。(4)阻断Caspase-8活性对角膜移植免疫排斥反应的影响构建穿透性小鼠角膜移植模型,通过结膜下注射caspase-8抑制剂,评估其对角膜移植免疫排斥反应的影响:(1)裂隙灯显微镜观察并记录角膜植片存活状态,并应用Kaplan-Meier方法进行统计分析;(2)通过苏木素-伊红染色(hematoxylin and eosin,HE)以及q RT-PCR分析caspase-8抑制剂对角膜植片病理改变的影响;(3)采用免疫荧光以及WB等技术检测角膜植片中caspase-8活性以及Foxp3表达水平的变化。结果:(1)角膜移植免疫排斥微环境中调节性T细胞相对含量增多,但其免疫抑制功能受损与同系角膜移植组相比,异系角膜移植组免疫排斥眼前节中Tregs的相对含量显著增多;进一步发现Tregs中Foxp3转录水平增多,但蛋白水平减少;体外共培养实验结果表明:角膜移植免疫排斥微环境中Tregs的免疫抑制功能受损,但中和免疫排斥微环境中TNF-α可恢复Tregs的免疫抑制功能。(2)调节性T细胞免疫抑制功能受损与Caspase-8表达上调有关通过WB及流式细胞术研究发现:角膜移植免疫排斥眼前节上清液预处理Tregs后,其细胞中的Foxp3蛋白水平明显降低、而活化形式的caspase-8显著增加,提示caspase-8可能与Treg细胞免疫抑制功能的改变有关;进一步通过体外实验发现:抑制caspase-8活性不仅可以补救Treg细胞的免疫抑制功能,还能恢复Foxp3的表达。(3)TNF-α中和性抗体治疗可明显延缓角膜移植免疫排斥反应免疫荧光以及ELISA的结果显示:免疫排斥过程中,眼内TNF-α的水平明显增加;体内实验发现:中和TNF-α不仅可以有效延长角膜植片的存活时间,还能明显减轻角膜移植术后的炎症反应;通过WB进一步发现,经TNF-α中和性抗体治疗后,角膜植片中caspase-8水平下降、Foxp3水平增加,提示TNF-α中和性抗体可能通过改善Treg细胞的免疫抑制功能发挥其抗免疫排斥效果。(4)阻断Caspase-8活性可显著延长角膜植片存活通过q RT-PCR、免疫荧光及WB等技术发现:免疫排斥的角膜植片不仅高表达caspase-8,并且活化形式的caspase-8的水平也明显增加;与未治疗组相比,caspase-8抑制剂治疗组角膜植片透明,炎细胞浸润及炎性细胞因子表达明显减少,角膜植片存活时间延长;通过WB进一步发现:经caspase-8抑制剂干预治疗后Foxp3蛋白水平明显增加,提示caspase-8抑制剂抗免疫排斥效果可能与增强Treg细胞免疫抑制功能有关。结论:(1)角膜移植术后发生免疫排斥时,其前房微环境导致眼内组织中的Tregs免疫抑制功能缺陷。(2)角膜移植发生免疫排斥时术后微环境的变化,主要是通过增强Treg细胞中caspase-8活性降低Foxp3蛋白稳定性,进而破坏Treg细胞的免疫抑制功能。(3)TNF-α中和性抗体及caspase-8抑制剂均可显著延缓角膜移植免疫排斥反应,在机制上可能与增强Foxp3的稳定性有关。