研究目的:皮肤光老化是指皮肤长期受紫外线UVA和UVB辐射而引起的过早衰老的过程。临床上,以皮肤纹理粗糙,干燥,皱纹增多,松弛,缺乏弹性,有不规则的色素沉着等为特征。光老化不仅使皮肤功能失调,还与多种皮肤疾病甚至皮肤肿瘤密切相关。应用防晒衣、防晒霜等减少皮肤日光照射量是从源头上预防光老化最有效的方法,但亦有很多局限。通过国内外文献调研发现,皮肤光老化的发生与紫外线(UV)诱导过度生成活性氧自由基(ROS)以及炎症反应等有关,而抗炎和抗氧化是防治皮肤光老化的方法之一。家蝇幼虫(Musca Demestica larvae),俗称蛆,又名五谷虫,干燥物系中药罗仙子,其提取物具有抗菌、抗病毒以及免疫调节等生物活性。本课题组前期研究发现,罗仙子富含蛋白提取物还具有一定抗炎、抗氧化、抗动脉粥样硬化以及抗衰老等作用。而皮肤光老化的发生与氧化应激和炎症反应有关,提示罗仙子提取物可能具有干扰或预防皮肤光老化发生的作用。鉴于此,本文以罗仙子为原材料,探索一个合适、便捷的方法提取其中具有抗氧化活性的蛋白或多肽成分,并观察其对紫外线诱导的皮肤光老化小鼠模型的防护作用,从组织病理学、氧化应激损伤机制、炎症反应等角度初步探讨可能的保护机制。研究方法1.罗仙子抗氧化肽的制备工艺研究(1)“提蛋白-酶解法”制备抗氧化肽:采用“碱溶酸沉法”提取罗仙子蛋白,而后用碱性蛋白酶Alcalase对其进行水解,并以DPPH自由基清除率为评价指标,通过单因素和正交试验优化酶解工艺条件;酶解液通过10kDa和5 kDa的超滤膜进行分步分离,分离后各组分进行蛋白或多肽浓度测定以及DPPH自由基清除活性测定,统计得率。(2)“水提醇沉法”制备抗氧化肽:测定水提醇沉后上清DPPH自由基清除活性,测定浓度并计算得率。(3)采用TSKgel G2000SW凝胶柱分析上清和沉淀的分子量分布,通过分子量分布、DPPH自由基清除活性和得率比较以选择合适的抗氧化肽制备方法。(4)罗仙子抗氧化肽抗氧化活性评价:以强抗氧化剂维生素C(VC)作对照,测定罗仙子抗氧化肽DPPH自由基、羟自由基、ABTS自由基的清除率,并与维生素C对各自由基的半数清除浓度(EC50)进行比较,评价其抗氧化活性。2.罗仙子抗氧化肽对UV诱导皮肤光老化模型保护作用研究实验采用56只雌性Balb/c小鼠,将其随机分为正常对照组(NC)、模型对照组(MC)、基质对照组(OC)、罗仙子抗氧化肽低剂量组-2%(L)、中剂量组-4%(M)、高剂量组-8%(H)和维生素E组(VE)。每日给予小鼠背部剃毛处理,外涂给药处理后1 h进行UVA和UVB照射,每周照射6天,持续6周,UVA和UVB累积辐照剂量分别为91.2 J/cm2和9.12 J/cm2(模拟日光UVA与UVB的比例)。造模结束后观察各组小鼠皮肤外观并拍照记录,测定各组小鼠背部皮肤厚度,评价罗仙子抗氧化肽对UV诱导小鼠皮肤光老化模型的保护作用。对小鼠皮肤组织进行HE染色观察、醛品红染色观察、透射电镜观察,测定小鼠皮肤组织中MDA含量,SOD、GSH-Px酶活力,金属基质蛋白酶MMP-1和MMP-3含量,炎症因子TNF-α、IL-1β和IL-6含量,初步探讨罗仙子抗氧化肽对小鼠皮肤光老化模型保护作用可能的机制。研究结果1.罗仙子抗氧化肽的制备工艺研究(1)“提蛋白-酶解法”制备抗氧化肽:采用“碱溶酸沉法”提取罗仙子蛋白后,单因素试验和正交试验确定了罗仙子蛋白最佳酶解工艺条件为:加酶量7000 U/g,底物质量浓度1%,酶解反应时间15 min,酶解温度50℃,pH值7.5。酶解液通过10 kDa和5 kDa超滤滤膜分步分离后,共收集到3个分子段组分,分子量范围分别为MW>10 kDa、5 kDa<MW<10kDa和MW<5 kDa,得率依次为9.06±0.14%、2.13±0.04%、1.30±0.02%;3个分子段组分DPPH自由基清除活性均随浓度的增加而升高,呈现出一定的量效关系;分子量大于10 kDa的组分清除DPPH自由基活性明显低于分子量在10 kDa以内的组分,MW<5kDa的组分活性最强。(2)“水提醇沉法”制备抗氧化肽:水提醇沉后收集上清,多肽得率为13.33±0.31%。(3)两种方法比较:“碱溶酸沉法”提取上清中含有一定比例的大分子量蛋白,而“水提醇沉法”提取上清中无,为分子量4 kDa左右小肽,提取过程简单,污染小,得率高,清除DPPH自由基活性强。因此,“水提醇沉法”提取上清中小肽适合制备抗氧化肽。(4)罗仙子抗氧化肽抗氧化活性评价:罗仙子抗氧化肽对DPPH自由基、ABTS自由基和羟自由基的半数清除浓度(EC50)分别为0.117、2.232、2.546 mmol/L(以平均摩尔质量和质量浓度计算所得),VC对各自由基的EC50与抗氧化肽的比值分别为:1∶6.5(DPPH·)、1∶3.97(ABTS·+)和0.84∶1(OH·)。VC是强抗氧化剂,与之对三种自由基的清除活性比较可以看出,罗仙子抗氧化肽亦具有较强的抗氧化活性。2.罗仙子抗氧化肽对UV诱导皮肤光老化模型保护作用研究与正常组相比,模型组小鼠皮肤厚度显著增加,出现大量红斑、脱皮现象,肤质粗糙、变硬;与模型组相比,罗仙子抗氧化肽中、高剂量组小鼠皮肤厚度明显降低,红斑和脱皮减少。HE染色和醛品红染色结果显示,中、高剂量组对UV诱导的角质层加厚,角质形成细胞过度增殖,排列不规则,真皮乳头消失,弹性纤维排列紊乱,断裂、成团等有一定的改善。与正常组相比,模型组MDA含量显著上升,SOD和GSH-Px活力显著降低,MMP-1和MMP-3含量显著升高,炎症因子TNF-α、IL-1β和IL-6含量显著升高;而与模型组相比,罗仙子抗氧化肽中、高剂量组MDA含量显著降低,SOD和GSH-Px活力显著提升,MMP-1和MMP-3含量显著降低,TNF-α、IL-1β和IL-6含量显著降低。结论本文采用“碱溶酸沉法”提取了罗仙子蛋白,并通过单因素和正交试验确立了罗仙子蛋白最佳酶解工艺条件为:加酶量7000 U/g,底物质量浓度1%,酶解反应时间15 min,酶解温度50℃,pH值7.5。采用10 kDa和5 kDa滤膜对酶解液进行分步超滤,其中5 kDa<MW<10 kDa和MW<5kDa的组分清除DPPH自由基活性较强,但得率均比较低。“水提醇沉法”收集上清中小分子肽分子量集中在4 kDa左右,无大分子蛋白,得率高,为13.33±0.31%,并且具有较强的清除DPPH自由基、ABTS自由基和羟自由基的活性。因此,本文选择“水提醇沉法”制备抗氧化肽。局部使用罗仙子抗氧化肽对小鼠皮肤光老化模型具有一定保护作用,这种保护作用可能与抑制UV诱导皮肤脂质过氧化,提高抗氧化酶SOD和GSH-Px活力,减少炎症因子TNF-α、IL-1β和IL-6表达,降低MMPs含量有关。