长节段周围神经缺损是目前临床的治疗难题之一。应用神经支架替代自体神经修复神经缺损已成为一种趋势。神经支架可为再生神经提供桥梁作用。然而,由于神经组织再生能力有限,对于长节段的神经缺损,受损神经需较长时间通过神经支架,这在一定程度上限制了神经支架修复长节段神经缺损的效果。因此,单纯依赖神经支架的桥梁作用及受损神经自身有限的再生能力,无法在长节段神经缺损中取得满意的修复效果。众所周知,神经系统处于复杂的电学微环境之中,神经组织在生长和改建的过程中均伴发电现象。大量研究表明:适宜的电刺激可有效激活受损神经元,引导神经生长锥定向再生,促进神经再生,因此,电刺激是促进神经再生的有效手段之一。然而,目前有关电刺激促进神经损伤修复的相关研究大多集中在神经挫裂伤、离断伤以及短节段神经缺损,电刺激在长节段神经缺损中的应用及机制研究较少。因此,建立有效促进神经再生和修复的电刺激模式,联合神经支架修复神经缺损有望提高长节段神经缺损的修复效果。本研究在制备具有轴向矩阵排列微管样结构的仿生神经支架的基础上,建立了两种可促神经再生的电刺激模式,即:(1)应用仿生支架桥接神经缺损后,术中短时程单次电刺激受损神经近端,激活受损神经元,加快神经再生,缩短神经轴突通过支架所需时间,促进功能恢复;(2)构建具有导电性能的仿生支架,以导电支架桥接神经缺损后,在导电支架局部给予术后间断多次电刺激,在导电支架局部构建利于神经损伤修复的电学微环境,促进神经再生和功能恢复。在明确了上述电刺激模式对神经缺损的修复效能后,在离体条件下,针对电刺激对外周神经胶质细胞雪旺细胞的生物学行为的调节作用进行深入研究。发现适宜的电刺激可有效调节雪旺细胞增殖、粘附、突起伸展以及合成神经营养因子的能力。该发现提示:电刺激对雪旺细胞生物学行为的调节作用是电刺激促进神经修复的可能机制之一。该研究极大的丰富了神经损伤修复的电化学机制,为电刺激在神经缺损中的应用提供了理论依据。整个研究分为以下三个部分:第一部分:神经近端给予电刺激与仿生支架联合修复神经缺损的有效性研究背景:神经支架可为再生神经提供桥梁作用。然而,由于神经纤维再生能力有限,对于长节段的神经缺损,受损神经需较长时间通过神经支架,这在一定程度上限制了神经支架修复长节段神经缺损的效果。因此,寻找可加快神经再生速度的方法与神经支架联合应用有望改善长节段神经缺损的修复效果。以往研究表明:神经损伤后给予神经近端电刺激可增强神经再生能力,加快神经再生。因此,神经支架桥接神经缺损后,在神经近端给予电刺激有望取得较单纯支架更好的修复效果。目的:探讨神经近端术中单次电刺激与仿生支架联合修复神经缺损的效能。方法:制备SD大鼠15mm坐骨神经缺损,应用仿生支架桥接神经缺损,神经支架移植后半数大鼠术中给予神经近端1h电刺激(20Hz),应用形态计量学分析及荧光金逆行标记评估术后神经再生情况;神经电生理、行为学分析以及靶器官的形态分析评估术后大鼠神经功能恢复情况。结果:仿生支架联合电刺激组神经再生及运动功能恢复程度显著优于其他各组。电刺激组神经再生较未刺激组提前2-4周完成。此外,神经电生理指标,坐骨神经指数以及靶肌肉的形态在电刺激组显著改善。结论:神经近端给予电刺激与仿生支架联合可促进神经缺损术后神经再生和功能恢复。第二部分:导电仿生支架与电刺激联合修复神经缺损的有效性研究背景:神经系统处于复杂的电学微环境之中,神经组织在生长和改建的过程中均伴发电现象。在神经缺损发生时,神经缺损局部的电学微环境缺失,势必会影响神经缺损的修复效果,因此,在神经缺损局部构建电学微环境对于神经缺损的修复具有重要意义。目的:探讨应用导电支架局部施加电刺激的方法重建神经缺损局部电学微环境的可行性,并明确该方法在桥接大鼠15 mm神经缺损中的效能。方法:制备可降解导电材料PPy/chitosan,并将该导电材料制备成具有轴向矩阵排列微管样结构的导电神经支架。制备SD大鼠15mm坐骨神经缺损(n=120),半数大鼠应用导电支架桥接神经缺损,剩余大鼠以非导电支架桥接。导电支架移植组(CS+ES组)和非导电支架组(NCS+ES组)各有半数大鼠接受电刺激(1h,20Hz,1次/2天,共8次),剩余大鼠不接受电刺激(CS-ES组、NCS-ES组)。术后不同时间点,应用形态计量学及荧光金逆行示踪标记评估神经再生情况;神经电生理、行为学检测以及靶器官形态分析明确运动功能恢复情况;应用Western blot检测神经支架局部蛋白(S-100、BDNF、P0及Par-3)表达的变化,以初步明确导电支架联合电刺激促进神经再生的可能机制。结果:CS+ES组再生有髓神经纤维的面积、直径、数目及髓鞘化程度显著高于NCS+ES组及CS-ES组;神经电生理检测、行为学分析显示:CS+ES组的运动功能恢复情况显著优于CS-ES, NCS+ES及NCS-ES组;CS+ES组腓肠肌萎缩程度较其他各组明显改善;此外,电刺激可上调导电支架局部S-100、BDNF、P0及Par-3的表达水平。结论:导电支架联合电刺激可显著加快神经再生,促进神经缺损后神经再生和功能恢复。第三部分:电刺激促进神经再生的机制——电信号对雪旺细胞的激活作用及机制研究背景:电刺激可在动物模型中促进神经再生,然而其机制尚未清楚。目前有关电刺激促进神经再生的机制研究主要集中在电刺激对神经元的影响,电刺激对雪旺细胞生物学行为的影响是电刺激促神经再生的可能机制之一,但一直未引起重视。目的:研究电刺激对雪旺细胞生物学行为的影响,明确细胞内钙在其中的参与作用。方法:将雪旺细胞接种于导电材料PPy/chitosan上,同时给予电刺激。应用流式细胞仪确定雪旺细胞对不同强度电刺激的耐受程度;应用DAPI染色及MTT实验研究电刺激对雪旺细胞增殖的影响,应用RT-PCR、Western blot以及ELISA明确电刺激对雪旺细胞合成及分泌NGF及BDNF的影响;应用钙成像技术确定细胞内钙在电刺激调节雪旺细胞生物学行为中的关键作用,同时应用药理学实验方法明确细胞内钙参与上述过程的具体机制。结果:导电材料PPy/chitosan具有良好的细胞相容性,可支持细胞粘附、伸展和增殖。在导电材料上接种雪旺细胞后给予电刺激,高强度的电刺激可致雪旺细胞凋亡增加,而适宜的电刺激可促进雪旺细胞增殖及粘附;此外,适宜的电刺激可促进雪旺细胞合成及分泌NGF及BDNF。钙成像结果表明:电刺激可开放细胞膜T型电压门控钙离子通道,同时活化细胞内IP3敏感性钙库及Ryanodine敏感性钙库,升高细胞内钙浓度,刺激雪旺细胞分泌NGF。结论:电刺激可调控雪旺细胞增殖、粘附及合成神经营养因子的能力,电刺激对雪旺细胞生物学行为的调节作用可能是电刺激促神经再生的机制之一。