貂阿留申病病毒(Aleutian Mink Disease virus,ADV)属细小病毒科阿留申病毒属成员,可以引起水貂慢性进行性疾病,即水貂阿留申病(Aleutian disease of mink, AD),以繁殖能力下降、貂体消瘦、自身免疫病、高免疫球蛋白血症、细菌感染的易感性增加、肾衰竭死亡为基本特征。目前,该病普遍存在于世界各地人工养殖的水貂种群中,给养貂业造成了极其严重的经济损失。中国黑龙江、吉林、辽宁、山东、新疆和内蒙古等省貂场也存在该病,血清抗体阳性率20%-30%。本研究从中国不同地区临床发病水貂分离鉴定获得3株ADV流行毒株,完成分离毒株编码区基因序列分析,建立成功该病毒TaqMan实时PCR和间接ELISA抗体检测方法,用杆状病毒表达系统成功表达该病毒VP2结构蛋白,阐明其免疫特性,为该病防控奠定了重要基础。具体研究内容分为以下5个部分：1.貂阿留申病病毒分离与鉴定用对流免疫电泳(CIEP)方法对国内主要的水貂养殖地区(山东、辽宁、黑龙江)疑似感染ADV症状的水貂进行ADV血清抗体检测,选择抗体阳性貂进行扑杀,剖检,无菌采取肝、脾、肾、肠系膜淋巴结样品,电镜观察发现细小病毒样颗粒。将研磨组织液过滤后加双抗,接种CRFK细胞,分离病毒,盲传6代,取细胞培养病毒液用PCR方法检测,证明分离获得3株ADV。将3株分离病毒接种健康水貂,隔离观察,接种后3天出现食欲减退,贫血,被毛无光泽,后期出现拒食、狂饮,死亡,个别貂具有神经症状,表现抽搐、痉挛、步态蹒跚,共济失调或后肢麻痹等症状,证明分离获得3株ADV,分别命名为ADV-LN1、ADV-LN2、ADV-LN3。2.貂阿留申病病毒分离株基因测定与分析采用PCR技术对ADV-LN1、ADV-LN2和ADV-LN3分离株进行编码区基因扩增、克隆和测序分析,结果获得完整编码区基因序列,长度为4543bp、4566bp和4566bp。基因序列分析结果显示,ADV-LN1、ADV-LN2、ADV-LN3与欧美毒株ADV-G、 ADV-Utahl、ADV-SL3相比核苷酸最高同源性结构蛋白VP1为97.4%,非结构蛋白最高同源性NS1、NS2、NS3分别为92.6%、93.3%、93.9%。推导的氨基酸最高同源性VP1为97.2%,NS1、NS2、NS3分别为89.2%、91.2%、92.0%。VP1基因长2064bp,编码688个氨基酸,与细小病毒属中PPV-Nanjing200801相似性最大(51.2%),病毒VP1遗传进化树分析表明,本病毒与细小病毒属VP1亲缘关系最近,中国分离毒株可能为远离欧美的新毒株或由美国ADV-Utah1毒株进化而来。生物信息学分析结果显示,该蛋白是一种保守不合信号肽的外膜蛋白,具有7个潜在的N-糖基化位点和34个磷酸化位点。二级结构分析显示无规则卷曲含量最高,达68.75%,α螺旋、β折叠分别为16.42%和14.83%；同源建模比对,构建了具有较高合理性和可靠性的三维空间结构；预测抗原表位主要位于肽链第254-265、96-112、317-348、514-523、629-645位区段。3.貂阿留申病病毒TaqMan实时PCR检测方法的建立与应用根据GenBank ADV-G毒株VP2基因的保守序列,设计合成了一套引物和TaqMan探针,在国内首次建立了实时荧光定量PCR方法,用于检测ADV。结果显示,该方法具有较好的特异性和重复性,对ADV的DNA检测下限为47.7copy/μL,敏感性比常规PCR高106倍。分别用该法和普通PCR方法对辽宁、山东规模化水貂养殖场60份有阿留申病临床症状的水貂组织病料样品进行ADV检测,结果两种方法符合率为95%,表明该方法具有更快速、灵敏、准确、低污染等优点,为我国进口水貂检验检疫及国内水貂养殖场针对ADV诊断提供了快速检测方法。4.貂阿留申病病毒VP2主要功能区原核表达与间接ELISA抗体检测方法的建立本研究利用PCR技术扩增ADV VP2基因片段,其长度为950bp,克隆至pET-28a(+)原核表达载体,构建获得重组载体pET-28a(+)-VP2,经酶切、PCR扩增和测序分析确证目的基因阅读框正确。重组质粒转化至宿主菌BL21(DE3),用异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)进行诱导表达,SDS-PAGE电泳结果证明该表达产物分子质量约为42kD,与理论推测的蛋白分子质量一致,经Western-blot分析证明,该重组蛋白可被ADV阳性血清所识别。采用纯化的VP2蛋白为包被抗原,成功建立间接ELISA抗体检测方法,通过比较试验、特异性试验、阻断试验和重复性试验,表明该方法具有较高特异性和灵敏度,重复性较好。用建立的ELISA方法和对流免疫电泳同时检测120份血清样品,两者符合率为95.8%,证明该方法可用于ADV抗体检测。5.阿留申病病毒VP2基因重组杆状病毒的构建与免疫特性研究将阿留申病病毒ADV-LN2株VP2基因克隆到载体pFastBacTMDual中,构建重组转座栽体pFBD-VP2,然后将其转化DH10Bac感受态大肠杆茵,将VP2基因整合到Bacmid穿梭栽体中,获得重组穿梭载体BacmidVP2;通过脂质体转染将其转染Sf9昆虫细胞,获得重组杆状病毒rBacVP2。用Western blot和间接免疫荧光试验分析表明ADV VP2蛋白在Sf9昆虫细胞获得正确表达,所表达的重组VP2蛋白分子量约35kD。将重组VP2蛋白加入弗氏不完全佐剂,免疫BABL/c鼠,同时采用ADV-LN2病毒灭活佐剂苗、野生型杆状病毒佐剂苗和不免疫为阴性对照,两次免疫,间隔3周,首次免疫后3和6周采血检测ELISA抗体,并取脾脏进行淋巴细胞增殖试验,结果为：免疫后3周重组VP2病毒即能使小鼠产生ADV的特异性IgG抗体,免疫后6周,脾淋巴细胞增殖实验证明重组病毒抗原能够诱导细胞产生良好免疫反应,从而为ADV基因工程疫苗研究奠定了基础,有较好应用前景。