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市场上鸡蛋颜色种类众多,绿壳蛋作为其中的一种深受广大消费者的偏好。由于绿壳蛋性状是一个重要的包装性状,广大育种工作者在绿壳蛋性状的利用与调控机制方面开展了大量的研究。目前,关于绿壳性状的形成机制已被阐明,SLCO1B3基因是决定绿壳性状发生的关键基因,该基因的表达会促使胆盐类运输至蛋壳腺,蛋壳腺将胆绿素分泌至蛋壳中,从而形成绿壳。然而生产中同一品种不同的鸡群,同一鸡群不同的产蛋时期,即使所有的鸡SLCO1B3基因都是显性纯合基因型,所产蛋蛋壳颜色深浅变化仍然很大。在卢氏绿壳鸡群中,随着产蛋周龄的增加,尤其是40周龄以后,绿壳蛋颜色显著变浅,极大地影响了企业的生产效益。然而导致蛋壳颜色变浅的原因以及我们应该怎样应对还不清楚?解析绿壳蛋蛋壳颜色变浅的原因对理论研究和生产实践意义重大。为此,本项目以同一批次、健康状况良好、饲养管理等条件一致的200只20周龄的卢氏绿壳蛋鸡为研究对象,通过研究产蛋周期内蛋壳颜色变化、SLCO1B3基因的表达水平及其甲基化水平并分析三者间的相关性,最终揭示绿壳蛋蛋壳颜色变浅的分子机制。通过饲粮中添加复合维生素分析维生素对蛋壳颜色变化的影响,来寻找解决蛋壳颜色变浅的有效策略或技术。本研究主要得出以下结果:1、不同产蛋期蛋壳颜色的变化规律分析采用NR色差计对同一批次的200只鸡在9个不同周龄(20、25、30、35、40、45、50、55及60周龄)所产蛋蛋壳颜色进行定量测定,每个时期连续测定3天,每个蛋测定3个点。各周龄蛋壳颜色平均值依次为53.53、53.86、56.14、56.59、56.95、56.88、58.57、57.79和58.40。据此可将卢氏绿壳蛋鸡产蛋周期分为3个阶段:20~25周龄为深绿色,26~45周龄为中绿色,46~60周龄为浅绿色。不同周龄间的方差分析表明,20~25周龄的蛋壳颜色显著深于30、35、40和45周龄(P<0.05),50和60周龄的蛋壳颜色显著浅于前45周龄(P<0.05)。卢氏绿壳蛋鸡整个产蛋周期存在两个拐点:分别为25、45周龄,25周龄后蛋壳颜色由深绿色变为中绿色,45周龄后蛋壳颜色由中绿色变为浅绿色。根据蛋壳颜色分布情况,可以推测在整个产蛋周期中蛋壳颜色读值主要集中在50~62范围内。结果表明:随着产蛋周龄的递增卢氏绿壳蛋鸡的蛋壳颜色逐渐变浅。2、不同产蛋期SLCO1B3基因的表达变化规律与蛋壳颜色的相关分析采集25、30、35、40、45、50、55及60周龄时的蛋壳腺组织样品,每个周龄采样5只鸡的蛋壳腺组织样品。通过绿壳蛋分子标记技术筛选显性纯合型个体,利用qRT-PCR技术测定显性纯合型个体SLCO1B3基因的相对表达量。发现25和30周龄卢氏绿壳蛋鸡SLCO1B3基因的表达量显著高于其他产蛋周龄的表达量(P<0.05),35、40及45周龄的表达量显著高于50、55及60周龄的,35、40和45周龄之间以及50、55和60周龄之间的表达量差异不显著(P>0.05)。通过不同时期SLCO1B3基因的表达量与对应时期蛋壳颜色进行Pearson相关分析,发现两者呈现显著的正相关,表达量与蛋壳颜色数值的相关系数为-0.729(P<0.05)。结果表明:随着产蛋周龄的递增SLCO1B3基因在蛋壳腺中表达量逐渐降低,导致蛋壳颜色变浅。3、不同产蛋期SLCO1B3基因的甲基化水平与该基因表达量、蛋壳颜色的相关分析分别选择不同产蛋期显性纯合型个体3只,利用重亚硫酸盐测序法技术测定SLCO1B3基因的启动子区的甲基化水平。发现25、30、35、40、45、50、55及60周龄的卢氏绿壳蛋鸡SLCO1B3基因在蛋壳腺组织DNA的启动子区的整体甲基化率分别为83.93%、84.37%、85.27%、87.76%、90.82%、91.67%、91.07%和91.33%,结果表明随着产蛋周龄的递增SLCO1B3基因在卢氏鸡蛋壳腺组织中的整体甲基化率逐渐增高。经Pearson相关分析,发现SLCO1B3基因启动子区的整体甲基化水平与其在蛋壳腺组织中的表达量极显著负相关,相关系数为-0.889(P<0.01);与蛋壳颜色显著负相关,甲基化水平与蛋壳颜色数值的相关系数为0.807(P<0.05)。对每个岛进行Pearson相关分析发现:CpG1、CpG5和CpG8甲基化水平与基因的表达量显著负相关(P<0.05),相关系数分别为-0.708、-0.779和-0.709;CpG1、CpG5和CpG8甲基化水平与蛋壳颜色显著负相关,这三个岛的甲基化水平与蛋壳颜色读值的相关系数分别为0.775(P<0.05)、0.710(P<0.05)和0.871(P<0.01)。经生物信息学分析发现CpG5和CpG8分别存在转录因子Sp1和Oct-1A的结合位点,所以我们推测可能是由于这两个岛的甲基化阻碍转录因子与启动子的结合,随着甲基化水平的提高,基因在产蛋后期表达量降低,从而蛋壳颜色变浅。4、复合维生素对卢氏鸡绿壳蛋蛋壳颜色变化的影响43周龄时将鸡群随机均分两组,其中实验组饲喂添加复合维生素的常规日粮,对照组则饲喂常规日粮。在45、50、55以及60周龄时分别测得实验组与对照组蛋壳颜色的值并采取蛋壳腺组织样品,每组各采样5只。通过绿壳蛋分子标记技术筛选显性纯合型个体,利用qRT-PCR技术测定显性纯合型个体SLCO1B3基因的相对表达量。发现实验组与对照组在45和50周龄的蛋壳颜色差异不显著,55周龄时实验组的蛋壳颜色显著深于对照组(P<0.05),60周龄时实验组测得的蛋壳颜色深于对照组,但没有达到显著水平。结果表明:在产蛋后期日粮中添加复合维生素有缓解蛋壳颜色变浅的趋势。综上所述,随着产蛋周龄的递增卢氏绿壳蛋鸡的蛋壳颜色逐渐变浅,SLCO1B3基因的表达量逐渐降低,SLCO1B3基因的整体甲基化水平逐渐升高;生物信息分析发现CpG5和CpG8分别存在转录因子Sp1和Oct-1A的结合位点,所以我们推测可能是由于这两个岛的甲基化阻碍转录因子与启动子的结合,随着甲基化水平的提高,基因在产蛋后期表达量降低,从而蛋壳颜色变浅;在产蛋后期日粮中添加复合维生素有缓解蛋壳颜色变浅的趋势。