20世纪90年代以来,抗生素的研究开发仍然以β-内酰胺类为主,尤其以半合成头孢菌素居多。头孢菌素的母核按其结构可分为7-ACA和7-ADCA两大类。在对头孢菌素的半合成研究中,由3-位去乙酰基的头孢中间体衍生得到的头孢类抗生素在临床应用中有其突出的优点,引起了化学家和生物学家对其的重视。将7-ACA转化为7-ADAC,获得的产物7-ADAC的3-位上有活性羟基,可以为后续的各种改造提供有利条件。 目前,7-ADAC是由7-ACA经化学或者酶法脱乙酰基而来的。化学法反应慢,而且容易形成内酯,为后续反应带来困难,因此,酶法生产7-ADAC的研究成为必要。本文研究了枯草杆菌和粘红酵母头孢菌素C乙酰水解酶的活性,对活性较好的粘红酵母进行了菌种选育及发酵条件的优化,获得了活性明显提高的菌株。同时,对反应条件进行了优化,使得反应在lh内完成,摩尔转化率大于99%。利用等电点沉淀的方法分离得到产物,纯度达98%以上。反应和纯化的摩尔总收率可达88%。 在以上研究基础上,本文还用PCR方法从枯草杆菌6633基因组DNA中扩增得到了头孢菌素C乙酰水解酶(CAH)的基因,并测定其核苷酸序列。利用基因重组技术构建了该基因的表达载体,并在大肠杆菌中进行了表达,经SDS-聚丙稀酰胺凝胶电泳验证,表达蛋白占蛋白总量的21.3%。