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1，3-丙二醇（1，3-propanediol，1，3-PD）是一种重要的化工原料，采用生物法制取1，3-PD的开发与研究在国内外受到越来越广泛的关注。甘油脱水酶是生物法代谢生产1，3-PD的关键酶和限速酶，因此对其的研究显得尤为重要。该文首先克隆表达了甘油脱水酶及其相关酶的基因，研究了它们的酶学性质，并从理性和非理性角度对甘油脱水酶进行了分子改造，利用同源建模构建了相关酶的三维结构，并利用三维结构信息分析探讨了三维结构和酶学性质之间的关系。主要取得结果如下：1甘油脱水酶及其相关基因的克隆表达、酶学性质及结构研究（1）克隆并高效表达了弗氏柠檬酸菌的甘油脱水酶基因dhaBCE，纯化后测定了该酶的酶学性质。并通过同源建模获得了该重组酶的三维结构信息，预测了该酶的活性中心。（2）克隆并高效表达了克雷伯氏菌的甘油脱水酶基因gldABC，纯化后测定了该酶的酶学性质。并通过同源建模获得了该重组酶的三维结构信息，预测了该酶的活性中心。（3）从甘油富集菌的宏基因组中克隆表达了一个基因，并确定为甘油脱水酶基因。通过同源建模获得了该酶的三维结构信息，活性中心的与底物结合的6个氨基酸残基中的Asp336位（位于大亚基）变为了Gly336，底物与周围氨基酸氨基之间的氢键与其它的甘油脱水酶相比均发生了变化，初步分析可能是造成此甘油脱水酶没有活力的原因。（4）克隆并高效表达了弗氏柠檬酸菌的1，3．丙二醇氧化还原酶基因dhaT。纯化后测定了该酶的酶学性质。并通过同源建模构建了其三维结构并分析了结构特征。（5）通过over-lap PCR方法将甘油脱水酶基因dhaBCE和1，3-丙二醇氧化还原酶dhaT基因首尾相连，构成一个多顺反子，实现了在大肠杆菌中的协同表达，液相和气相色谱均显示有1，3-PD的产生和积累。（6）克隆并协同表达了弗氏柠檬酸菌甘油脱水酶的激活因子基因dhaF和dhaG，纯化后研究其激活性质表明：此激活因子不但可以激活本身的甘油脱水酶，而且还可以交叉激活克雷伯氏菌和产气荚膜梭菌两个不同种属的甘油脱水酶，但并不能激活巴氏梭菌的甘油脱水酶；并通过同源建模方法构建了该激活因子的三维结构。（7）克隆并协同表达了克雷伯氏菌甘油脱水酶的激活因子基因gdrA和gdrB。纯酶的激活实验表明，此激活因子不但可以激活本身的甘油脱水酶，而且还可以交叉激活弗氏柠檬酸菌和产气荚膜梭菌两个不同种属的甘油脱水酶，但并不能激活巴氏梭菌的甘油脱水酶；并通过同源建模方法构建了该激活因子的三维结构。2甘油脱水酶高通量筛选体系采用双层指示平板，根据直观的颜色反应，建立了一套甘油脱水酶的高通量的筛选方法，筛选在非正常条件下（酸性、碱性和高温等）的突变酶，该方法可以大大降低背景的影响，简捷、高效。3甘油脱水酶的定向进化（1）以五种不同种属来源的甘油脱水酶基因为材料，利用DNaseI和内切酶结合法进行familiy shuffling，虽然没有筛选到酶学性质得到改善的突变子，但序列分析显示基因间发生了强烈的重组，实验为family shuffling的继续开展奠定了基础。（2）通过error-prone PCR方法对克雷伯氏菌的甘油脱水酶基因进行随机突变研究，得到了稳定性明显改善的两个突变酶，GDHtKP5-2和GDHtKP6-1，其中GDHtKP6-1在pH6.0条件下的半衰期是野生酶的16倍，并且45℃和50℃时的稳定性得到了明显的提高，45℃时的半衰期大约是野生酶的6倍。通过同源建模初步分析了野生型和突变型GDHt在三维结构上的差异；并通过能量计算，探讨了它们酶学性质差异的原因。4甘油脱水酶的理性设计（1）通过能量的理性设计，对来自于弗氏柠檬酸菌、克雷伯氏菌和宏基因组的甘油脱水酶的大、中-小亚基进行了异源亚基之间的杂合改组，结果表明：部分杂合酶具有活力，其酶学性质也得到明显改善。杂合酶GDHt（KU）使来源于宏基因组的本没有活力的甘油脱水酶获得了活力，虽然比活力比较低，但其热稳定性得到了非常明显的提高；另外，杂合酶GDHt（CK）和GDHt（KC）在酸性条件下的稳定性均得到了明显的提高。最后，通过同源建模初步分析了野生型和杂合型甘油脱水酶在三维结构上的差异，并探讨了它们酶学性质差异的原因。（2）通过PoPMuSiC理性设计，对克雷伯氏菌甘油脱水酶进行了定点突变，结果显示：突变体的酸碱稳定性有较明显的改善，突变体GDHtKP525在酸碱条件下的半衰期提高了约1.5～2倍；GDHtKP60在碱性条件下的稳定性得到了提高。通过同源建模初步分析了野生型和突变型甘油脱水酶在三维结构上的差异，并探讨了它们酶学性质差异的原因。（3）结合ProSa理性设计，对弗氏柠檬酸菌甘油脱水酶进行饱和突变研究，结果显示：突变体的酶学性质有一定程度的改善，突变体283-2-1和283.3-3的Km值均有一定程度的升高，突变体283-2-1的Km值明显变大，约是野生酶的2～3倍。突变体297-6-12的Km值明显变小，约是野生酶1／3～5；突变体297-6-11的Km值虽有升高但不明显，而Vmax值提高比较明显，约是野生酶的2～3倍，其中对甘油的Vmax值提高了约3.3倍。而α222位点的突变体的酶学性质均没有得到改善。通过同源建模初步分析了野生型和突变型甘油脱水酶在三维结构上的差异，并探讨了它们酶学性质差异的原因。据我们所知，有关甘油脱水酶理性和非理性分子改性的系统研究，在国内外均无报道，我们是首次开辟了这一领域的研究。本研究为国内外深入了解甘油脱水酶性质与结构的关系以及生物法高效生产1，3-PD奠定了良好的基础。