论文部分内容阅读
研究背景皮肤创面愈合涉及多种组织和细胞之间动态且协调有序的相互作用。在这些过程中,创面再上皮化和创面收缩是决定愈合效果的两个关键因素。表皮干细胞（Epidermal stem cells,EpSCs）是皮肤特异性干细胞,更新能力极强,是维持皮肤自我更新、参与损伤修复的关键细胞。在正常生理条件下,EpSCs锚定于干细胞巢等细胞微环境中,通过自我更新及分化来维持皮肤的新陈代谢。当创伤发生后,皮肤残存的EpSCs被激活并产生大量的快速扩增细胞,并通过迁移来完成再上皮化过程。因此,EpSCs生物学效应的发挥在创面再上皮化中具有重要作用。在皮肤损伤发生后即刻,局部TGF-β1及PDGF水平明显升高,刺激周围组织中的成纤维细胞向创面聚集。成纤维细胞分泌胶原和细胞外基质,在创面部位形成肉芽组织,为后续修复提供物质基础和营养保障。同时,在创面微环境的作用下,成纤维细胞转化为收缩和分泌功能更强的肌成纤维细胞,通过自身收缩力带动创面组织的位移,缩小创面区域。不同于高剂量光动力疗法（Photodynamic Therapy,PDT）产生的杀伤效应,低剂量的PDT可产生可控的少量ROS,作为第二信使分子广泛影响细胞信号转导通路,参与细胞生物学效应的调控。因此,我们计划以创面再上皮化和创面收缩为着眼点,探索光动力治疗在皮肤创面愈合中的运用,为皮肤创面修复寻找新的、经济高效的治疗手段。第一部分:低剂量ALA-PDT对创面修复的影响研究目的:探究低剂量ALA-PDT对皮肤创面愈合的影响。研究方法:1、低剂量ALA-PDT在皮肤创面及周围组织中产生ROS。构建小鼠背部皮肤全层缺损创面模型,用3%ALA孵育后观察PpⅨ富集情况。ALA-PDT后,通过活体成像系统和荧光显微镜观察创面组织中ROS荧光探针的信号。2、低剂量ALA-PDT对皮肤创面愈合的影响。构建小鼠创面模型,观察并比较ALA-PDT处理后创面愈合情况。结果:1、低剂量ALA-PDT在皮肤创面及周围组织中产生ROS。ALA孵育之后,小鼠背部皮肤出现特有的砖红色荧光,且范围与敷药范围一致。ALA-PDT后,仅在PDT组小鼠创面及周围组织中观察到ROS的荧光信号。2、低剂量ALA-PDT促进皮肤创面的愈合。构建创面模型后第1天、第5天各进行一次ALA-PDT后,在观察的时间点内PDT组小鼠创面愈合速度显著快于对照组。结论:1、低剂量ALA-PDT能够在小鼠皮肤创面及创面周围组织中产生ROS,且显著促进皮肤创面愈合速度。第二部分:低剂量ALA-PDT在创面再上皮化中的作用及机制研究目的:研究低剂量ALA-PDT对EpSCs生物学功能的影响,以及在皮肤创面再上皮化中的作用。研究方法:1、低剂量ALA-PDT对小鼠EpSCs增殖及凋亡的影响。分离并培养小鼠EpSCs,通过流式细胞术检测Ki-67阳性细胞比例。采用Annexin V-FITC/PI双染的方法来观察ALA-PDT对EpSCs凋亡的影响。2、低剂量ALA-PDT对小鼠EpSCs分化的影响。使用流式细胞术分别检测细胞表面标记（CD49f-CD71）和胞内标记（K15/K14/K10）,来研究ALA-PDT对EpSCs分化的影响。3、低剂量ALA-PDT对小鼠EpSCs迁移的影响。采用细胞划痕实验来观察。4、低剂量ALA-PDT对创面再上皮化的影响。构建小鼠创面模型,通过HE染色比较创面新生上皮的长度及上皮尖端之间的距离。通过免疫荧光染色比较创缘表皮细胞中Brd U的富集情况。通过免疫组化染色比较创缘表皮PCNA、IGF-1的表达情况。5、低剂量ALA-PDT对小鼠皮肤创面EpSCs分化的影响。分离创面周围的表皮细胞制作单细胞悬液,使用流式细胞术分别检测细胞表面标记（CD49f-CD71）和胞内标记（K15/K14/K10）。结果:1、低剂量ALA-PDT对小鼠EpSCs增殖及凋亡的影响。处理24h后,体外培养小鼠EpSCs Ki67阳性的比例高达85.33%,显著高于另外三个组（P＜0.01）。细胞凋亡实验显示,处理后12h四个组凋亡比例无统计学差异（P＞0.05）。2、低剂量ALA-PDT促进小鼠EpSCs分化。细胞表面标记染色结果显示,低剂量ALA-PDT处理后CD49f+-CD71+细胞比例较另外三个组显著增加（P＜0.05）;细胞内标记染色显示,处理后K14阳性的细胞比例显著增加（P＜0.01）,K10和K15的表达在各组间无明显差异（P＞0.05）。3、低剂量ALA-PDT促进小鼠EpSCs迁移。细胞划痕实验显示,细胞处理后24h和48h,PDT组迁移率显著高于另外三个组,分别为16.86%（P＜0.05）和61.40%（P＜0.01）。4、低剂量ALA-PDT促进创面再上皮化。HE染色结果显示,处理后第5天,PDT组新生上皮平均长度为563.34μm,显著长于另外三组（P＜0.05）。在后续时间点也观察到,PDT组小鼠创面新生上皮形成加快,创面闭合更早。低剂量ALA-PDT显著增加创缘表皮中Brd U、PCNA阳性细胞比例（P＜0.01）和IGF-1的表达（P＜0.01）。5、低剂量ALA-PDT促进小鼠皮肤创面EpSCs的分化。分析创面周围的表皮细胞发现,低剂量ALA-PDT显著提高了CD49f+-CD71+表型细胞的比例（PDT组27.98%vs.Control组13.32%,P＜0.01;PDT组vs.Irradiation组14.05%,P＜0.01;PDT组vs.ALA组17.58%,P＜0.05）;胞内染色结果也显示ALA-PDT显著提高了K14+细胞的比例（P＜0.01）。结论:1、低剂量ALA-PDT促进小鼠体外培养EpSCs的增殖和分化,而不会对细胞产生明显的杀伤。2、低剂量ALA-PDT促进小鼠EpSCs的迁移。3、低剂量ALA-PDT促进小鼠创面的再上皮化,加速皮肤创面的闭合。4、低剂量ALA-PDT促进小鼠皮肤创面周围组织EpSCs的增殖和分化。第三部分:低剂量ALA-PDT在创面收缩中的作用及机制研究目的:探索低剂量ALA-PDT对小鼠成纤维细胞向肌成纤维细胞的转化的调控,以及对创面收缩的影响。研究方法:1、低剂量ALA-PDT对小鼠成纤维细胞向肌成纤维细胞转化的影响。检测处理后肌成纤维细胞标志α-SMA在蛋白水平和m RNA水平的变化。利用凝胶收缩实验观察低剂量ALA-PDT处理后小鼠成纤维细胞的收缩能力变化。PDT对细胞迁移能力的影响将通过划痕实验来检测。利用Western blot和ELISA分别检测低剂量ALA-PDT后小鼠成纤维细胞I、Ⅲ型胶原的表达和分泌情况。2、低剂量ALA-PDT通过PI3K/AKT/mTOR通路调控小鼠成纤维细胞的转化。利用Western blot检测低剂量ALA-PDT后15min、30min、1h、2h小鼠成纤维细胞PI3K、AKT、mTOR蛋白表达和磷酸化水平。3、低剂量ALA-PDT对小鼠皮肤创面收缩的影响及机制。构建小鼠创面模型,通过HE染色观察并比较ALA-PDT处理后创面真皮层之间的距离及肉芽组织的变化情况。利用Western blot和免疫组化染色比较创面组织中TGF-β1的表达情况。4、低剂量ALA-PDT促进小鼠皮肤创面胶原重塑。通过免疫荧光染色观察比较不同愈合阶段真皮组织中α-SMA及Vimentin的表达变化。利用Masson染色和天狼星红染色观察创面愈合后组织胶原的分布情况。结果:1、低剂量ALA-PDT促进小鼠成纤维细胞的转化。处理后24h,细胞内α-SMA荧光信号明显增强。α-SMA蛋白和m RNA水平分别升高1.72倍（P＜0.001）和1.61倍（P＜0.001）。处理后12h和24h,对照组的迁移率分别为29.91%和76.21%,均显著低于另外三个组（P＜0.0001）。凝胶收缩实验示,PDT组凝胶剩余面积在第4天为34.27%,而Control组在第5天仍未观察到明显的收缩（P＜0.0001）。ALA-PDT处理后24h,细胞内?型和Ⅲ型胶原蛋白表达分别升高2.80倍（P＜0.001）和3.17倍（P＜0.0001）。ELISA结果显示,处理后的细胞培养上清中,?型和Ⅲ型胶原蛋白水平分别升高4.86倍（P＜0.0001）和1.26倍（P＜0.01）。2、低剂量ALA-PDT通过PI3K/AKT/mTOR通路调控小鼠成纤维细胞向肌成纤维细胞的转化。Western blot结果显示,处理后15min,细胞内p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT迅速升高,而下游的p-mTOR/mTOR则在1h时升高。3、低剂量ALA-PDT通过调控TGF-β1的表达促进创面收缩。HE染色结果显示,ALA-PDT显著缩短创面真皮层间的平均距离（P＜0.05）。Western blot结果显示,PDT组在第3天时组织中TGF-β1的表达量即显著升高,到第5天时即达峰值。免疫组化染色也显示出类似的变化趋势。4、低剂量ALA-PDT促进小鼠皮肤创面胶原重塑。免疫荧光结果显示,处理后的第5天,PDT组的真皮组织中α-SMA及Vimentin的表达均明显高于Control组;第9天时,PDT组两者的表达均明显下降,低于Control组。Masson染色和天狼星红染色显示,ALA-PDT后创面胶原纤维的排列紧密规则,且主要为?型胶原。结论:1、低剂量ALA-PDT促进小鼠成纤维细胞的转化,并增强其分泌功能。2、低剂量ALA-PDT促进小鼠成纤维细胞的迁移。3、低剂量ALA-PDT通过激活PI3K/AKT/mTOR通路来调控小鼠成纤维细胞生物学功能。4、低剂量ALA-PDT促进小鼠创面收缩,加速皮肤创面的闭合,缩短愈合时间。5、低剂量ALA-PDT通过调控TGF-β1的表达,加速愈合晚期肉芽组织吸收,促进创面修复后组织的重塑,加速创面愈合进程。