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疟疾(Malaria)是全球广泛关注的重要公共卫生问题之一。该病是由蚊虫叮咬后子孢子(Sporozoites)进入人体从而引起疾病,可引起人类患病的疟原虫包括恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)、间日疟原虫(Plasmodiumvivax)、三日疟原虫(Plasmodium malarial)、卵形疟原虫(Plasmodium ovale)和诺氏疟原虫(Plasmodium knowlesi)。其中,恶性疟原虫致病力和危害最为严重,非洲大约99.7%的疟疾病例是由恶性疟原虫所导致的。根据世界卫生组织(World Health Organization,WHO)疟疾报告,2017年全世界有2.19亿疟疾病例。在疟疾流行地区,某些病人在没有感染疟原虫的情况下可患有“疟疾样”发热,从而可导致错误使用抗疟药进行治疗。为防止抗疟药物滥用,世界卫生组织建议所有疑似疟疾病例的患者在使用抗疟药进行治疗之前需要使用显微镜或快速诊断试剂(Rapid diagnostic reagents,RDTs)来确诊。RDTs是采用双抗体夹心法原理定性检测人血中组氨酸富集蛋白2(Histidine-rich protein2,HRP2)用于恶性疟原虫的诊断。如果血样中含有HRP2抗原,将与金标抗HRP2抗体反应形成复合物,在层析作用下,被预先固定在膜上的抗HRP2抗体捕获,在检测区形成一条紫红色条带,此为阳性结果。由于RDTs操作简单,使用方便,成本低,结果可信而在全世界范围内被广泛应用。据WHO估算,2016年全球共交付3.12亿份RDTs,其中2.69亿份RDTs被在非洲地区使用。2010年在秘鲁亚马逊地区首次报道发现缺失Pfhrp基因的恶性疟原虫株。随后,在巴西、马里、塞内加尔和印度均有报道发现了缺失Pfhrp2基因的野生株。再有,位于恶性疟原虫PF3D7的13号染色体的Pfhrp3基因也富含组氨酸序列,因而其对于主要检测恶性疟原虫PfHRP2抗原的RDTs可能具有辅助作用。鉴于PfHRP2蛋白的有无,大小和所含的特征性重复序列存在诸多变异并可影响快速诊断试剂,因此获得缺失或删除Pfhrp基因的恶性疟原虫以便考核与评价以HRP2为基础的RDTs,基于考核结果对以HRP2为基础的RDTs提出建议。由于收集的恶性疟原虫感染者的血液样本中未发现缺失Pfhrp2基因的虫株,且随着基因编辑技术尤其是 CRISPR-Cas9(clustered regularly interspaced short palindromic repeats and CRISPR-associated protein 9)方法取得的极大进步,有鉴于此,本课题组选择遗传背景清楚的恶性疟原虫国际标准株PF3D7,采用CRISPR-Cas9方法来特异性删除该恶性疟原虫国际标准株的hrp基因外显子2(exon 2)区域,包括设计了一个含有特异性sgRNA(single guide RNA)和重组同源臂及一个含有Cas9核酸内切酶共计两个质粒,电转化入疟原虫后,sgRNA可将Cas9酶靶向至Pfhrp2基因从而产生缺口诱发同源重组,经药物筛选后获得基因删除的疟原虫。随后提取转基因疟原虫的基因组DNA进行聚合酶链式反应,基因测序,蛋白免疫印迹(Western blot,WB)和Southern印迹(Southern blot)等试验证明了Pfhrp2 基因被从恶性疟原虫基因组删除,成功获得了删除Pfhrp2基因的恶性疟原虫参考虫株。使用删除Pfhrp2的恶性疟原虫来考评已经获得国家药品监管机构批准的用于快速诊断恶性疟原虫感染的基于HRP2的RDTs。检测结果发现,若血液中含有删除Pfhrp2基因的恶性疟原虫低于1000个虫/微升,则基于HRP2的RDTs不能检测出恶性疟原虫感染。若血液中删除Pfhrp2基因的恶性疟原虫大于等于1000寄生虫/微升,则基于HRP2的RDTs仍可检出恶性疟原虫感染。为了深入研究在删除Pfhrp2基因后,应用以HRP2为基础的RDTs仍可检出患者感染恶性疟原虫这一疑问,本课题组重组表达了与HRP2高度同源的HRP3(Histidine-rich protein 3,HRP3)蛋白来开展研究。WB试验结果表明,无细胞蛋白表达系统成功制备了HRP3蛋白,证明了 HRP3蛋白可与识别HRP2蛋白的单克隆抗体结合,证实了HRP3蛋白的辅助诊断作用。综上所述,试验结果证实使用CRISPR-Cas9方法可在实验室建立删除Pfhrp2基因且遗传背景清楚的恶性疟原虫参考虫株;使用基因删除虫株考核基于HRP2的RDTs时,若恶性疟原虫的染虫率较低时,基于HRP2的RDTs可产生假阴性结果;若恶性疟原虫的染虫率较高时,基于HRP2的RDTs检测仍可获得阳性结果,可能的原因是HRP3辅助诊断恶性疟原虫感染。基于这些结果,恶性疟原虫流行区仍可继续使用基于HRP2的RDTs进行疾病诊断,若出现疑似假阴性的检测结果,应联合使用可检测其它抗原的RDTs再次检测以避免做出错误诊断。