贝类三种组织血型抗原ELISA检测方法的建立与季节变化规律研究

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诺如病毒(Noroviruses,NoVs),属于杯状病毒科(Caliciviridae),是一种引起非菌性急性肠胃炎的主要病原体,包括多种形态相似和基因型多样的亚型。感染人类的诺如病毒有GGI、GGII和GGIV,它们分别各有15、18和1个亚型。据统计,在美国诺如病毒每年大约引起2300万例胃肠炎病例,占所有食源性疾病的50%-67%。研究结果表明人类组织血型抗原(histo-blood groupantigens,HBGAs)是NoVs的结合受体。目前已经发现了人类HBGAs与人类诺如病毒或者与GI或GII的重组诺如病毒(rNVLP)的8种代表性的结合模式。HBGAs是复杂的碳水化合物,分布于红细胞表面以及呼吸道、生殖道黏膜和消化道上皮细胞表面,同时也以游离低聚糖形式存在于唾液、肠内容物、乳汁及血液等体液中。HBGAs的表达是由多基因系控制的,Lewis血型系统、分泌型和ABO血型系统是三种主要的人体HBGAs系统。NoVs引起的胃肠炎往往与食用了受NoVs污染的生的或未烹饪完全的双壳贝类有关,尤其是牡蛎。双壳贝类是高风险的食物,因为它们是滤食性动物,很容易从污染的海水中富集大量的病毒粒子。研究表明重量为1kg的双壳贝类每小时可以滤食90L的海水。目前贝类富集NoVs的机理还不是十分确定,但富集过程涉及到机械性的包埋,包括直接化学键、范德华力、氢键以及其他形式的离子键。人类胃肠细胞上的HBGAs被认为充当了病毒粒子的受体。所以,我们假设,牡蛎中也可能存在类似的HBGAs并且特异性的富集NoVs。人类的ABO血型系统已经研究的比较清楚,在其他物种中类似的ABO碳水化合物抗原也有了报道。本论文利用人组织血型抗原单克隆抗体,研究建立了贝类中A、H型和B型HBGAs的ELISA检测方法。通过设置阳性和阴性对照,以P/N值作为判断阳性的依据和贝类含量差异的定量标准,对我国六种贝类中的HBGAs进行了检测和分型,探究了不同城市不同季节的贝类中HBGAs的表达差异情况。主要研究结论如下:1、建立了贝类中A、H型和B型HBGAs的ELISA检测方法。A型、H型检测方法确定的主要条件为:包被浓度和包被时间分别为1g:3mL、2h,单克隆抗体的工作浓度和反应时间为1:1200、1.5h,二抗的反应条件为37℃孵育2h;B型HBGAs的ELISA检测方法确定的主要条件为:包被浓度和包被时间分别为1g:4mL、1h,单克隆抗体的工作浓度和反应时间为1:400、1.0h,二抗的反应条件为37℃孵育1.5h。2、检测了我国9个沿海城市6种贝类中的HBGAs的类型。对2011年不同季节从大连、烟台、威海、青岛、日照、连云港、舟山、厦门、广州等9个城市采集的81份牡蛎、65份缢蛏、77份菲律宾蛤仔、57份紫贻贝、72份毛蚶、69份扇贝等贝类样品进行了检测。结果显示上述六种贝类中都检测出A型抗原,其中菲律宾蛤仔的检出率为11.6%(9/77),紫贻贝的检出率为28.1%(16/57),缢蛏样品的检出率为72.3%(47/65),扇贝样品的检出率为84.6%(58/69),所有检测的牡蛎和毛蚶样品都含有A抗原;只有牡蛎样品检出H抗原,检出率为30.7%(28/91);缢蛏和毛蚶样品都检测出B型抗原,检出率分别为76.9%(50/65)和77.8%(56/72)。3、初步分析了我国6种贝类中HBGAs随季节的分布规律。在舟山、厦门和广州这三个南方城市中,牡蛎样品A抗原在10月-12月份的含量比较高;其中,舟山缢蛏样品A抗原平均水平较高;舟山和广州的扇贝样品A抗原含量从7月份到12月份呈现逐渐增加的趋势,在大连、烟台、青岛、日照这四个北方城市中,6月份左右含量较高;在大连、烟台、威海、青岛、日照这五个北方城市中,毛蚶样品A型抗原冬季其含量较低,其最高的阶段出现在夏季,在三个南方城市中,11月和12月份的含量相比其他月份都较高。本论文建立了贝类中三种HBGAs的ELISA检测方法,分析了6种双壳经济贝类中的三种HBGAs的类型,结果显示贝类中的HBGAs不止一种类型,该研究结果拓展了对双壳贝类表达HBGAs的认识,为贝类富集诺如病毒机理的研究奠定了基础,并初步探索了不同贝类中组织血型抗原随季节表达的规律,为预防NoVs疫情暴发提供了参考。
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