硫化氢(Hydrogen sulfide;H2S)是一种内皮依赖性的极化因子,它改善了外周血管的舒张功能,被视为是继一氧化氮(nitric oxide;NO)和一氧化碳(carbon monoxide;CO)之后的第三种新型气体信号分子。近年来虽然也有若干文献报道了中枢神经系统的H2S对外周心血管系统的调节功能,但机制并不明确。参与H2S合成的两种最重要的酶是胱硫醚-β-合酶(cystathionine beta synthase;CBS)和胱硫醚-γ-裂解酶(cystathionine gamma lyase;CSE)。CBS主要分布在海马、小脑、皮层和脑干等部位,其中以海马和小脑分布较高,CSE则主要分布于神经系统以外的外周组织。据报道H2S对心血管功能的调节发挥重要作用。如H2S可以调节消化道和血管平滑肌的张力;还可以舒张血管和抑制血管平滑肌细胞增殖;减轻大鼠离体心脏缺血再灌注损伤和降低自发性高血压大鼠(spontaneously hypertensive rats;SHR)血压。在中枢神经系统,H2S通过刺激神经细胞增加了细胞内环腺苷酸水平;通过提高受体介导的兴奋性突触后电位,可以诱导海马的长时程增强效应;H2S还可以通过中枢核团,对外周的心血管功能进行调节。外周H2S诱导的舒血管效应有别于其他内源性气体信号分子,它是通过直接开放血管平滑肌KATP通道而发挥作用的。然而,有关H2S在中枢调控中的机制尚未明瞭。中枢神经系统对心血管系统有着重要的调节作用,延髓头端腹外侧(rostralventr lateral medulla;RVLM)是重要的心血管中枢,它可以整合来自室旁核等心血管相关核团的投射,维持心血管交感紧张性活动。曾有研究表明RVLM区有CBS蛋白表达。本研究旨在应用基因过表达技术、心血管功能学、western blot、核团显微注射和免疫组化等方法探讨内源性H2S在RVLM对心血管调节功能及其作用机制。研究分为三部分:(1)构建CBS载体质粒,并将其包装到腺病毒体内,显微注射到RVLM区,并通过测定RVLM区CBS的表达和H2S的含量,证明其表达成功。(2)应用基因过表达,核团微量注射,Western blot等方法观察CBS/H2S系统在RVLM区对血压正常大鼠交感神经的调控作用,并探讨其机制。(3)应用基因过表达,核团微量注射,Western blot等方法观察CBS/H2S系统在RVLM区对SHR交感神经活动的调控作用,并探讨其机制。第一部分RVLM区过表达CBS基因对CBS蛋白和H2S水平的影响目的:H2S具有与NO和CO相似的生物学特性,被认为是第三种气体信号分子。由于H2S本身存在半衰期短、代谢快的特点,给长期给予H2S制造了瓶颈。随着医学技术的发展,基因治疗作为有别于传统药物治疗的新治疗手段显示出巨大的潜力,重组腺病毒载体携带目的基因过表达技术日益成熟。RVLM中转染携带CBS基因的腺病毒,能够长期生成H2S,为在中枢神经系统探讨H2S的基因治疗奠定理论和实验基础。方法:将CBS c DNA(Gen Bank:M88344.1)连接到质粒PMD19-Simple-T中,并将连接好的质粒PMD19-Simple-T-CBS包装到腺病毒载体上。将Ad CBS转染到PC12细胞中,测定最佳MOI值,同时测定了CBS和H2S的含量。显微注射到大鼠的RVLM区,使CBS蛋白在RVLM区过表达。观察CBS的表达周期,测定了RVLM区CBS蛋白和H2S的含量的变化周期。结果:通过Western blot、PCR及基因测序等方法证明已经将CBS的c DNA成功插入到PMD19-Simple-T质粒中。随后将PMD19-Simple-T-CBS质粒包装到腺病毒载体中(adenoviral vectors carrying CBS gene,Ad CBS)。Ad EGFP(adenoviral vectors carrying enhanced green fluorescent protein)组为对照组。转染前后每隔一天,取RVLM区,观察荧光,CBS蛋白和H2S的含量。实验结果发现,在转染Ad CBS后的第7天,RVLM区荧光最强,CBS蛋白和H2S水平最高,证明CBS成功转染到RVLM区了。结论:将CBS的c DNA插入到了PMD19-Simple-T质粒中,随后包装到腺病毒载体中,并成功将Ad CBS转染到RVLM区,CBS蛋白和H2S含量明显增加。第二部分RVLM过表达CBS对正常大鼠H2S介导的交感神经活动的调控目的:H2S是一种内源性气体信号分子,在外周具有舒张血管抵抗高血压等保护作用,但其在中枢神经系统对心血管的调控机制众说纷纭,尚不明了。曾经报道在RVLM区急性注射硫氢化钠具有交感抑制的效果。当前的实验判定长期在RVLM给予H2S对血压和交感神经活动的影响。方法:在本实验中,血压正常大鼠RVLM区Ad CBS转染7天后,进行急性实验。首先,基因转染前后每隔一天测定清醒状态下各组大鼠的收缩压(Systolic blood pressure;SBP)和心率(heart rate;HR)。同时,我们也测定了RVLM区CBS蛋白表达和H2S的含量。增加的CBS蛋白表达量和H2S的水平在基因转染7天后达到最高。因此,在基因转染后的第7天进行急性实验。其次,为了判定RVLM区过表达CBS对内源性H2S介导的交感神经抑制活动的影响,羟胺(hydroxylamine,HA;10,25 and 50 m M,100nl)或amino-oxyacetate(AOA;1 m M,100nl)被显微注射到RVLM区,并同时记录了肾交感神经活动(renal sympathetic nerve activity;RSNA),平均动脉压(mean arterial pressure;MAP)和HR。再次,为了判定内源性H2S介导的交感神经抑制活动是否由KATP通道介导,在RVLM区显微注射HA之前,预先注射了一种KATP通道激动剂pinacidil;为了判断KATP通道是否参与了Ad CBS组增强的内源性H2S介导的交感神经抑制活动,RVLM区注射了KATP通道阻断剂,格列苯脲(glibenclamide;Gli)。最后,实验结束时取RVLM区组织,测定了KATP通道蛋白SUR1,SUR2,Kir6.1和Kir6.2的表达情况。结果1 RVLM区注射Ad CBS 7天后,检测RVLM区CBS表达和H2S的含量。基因转染7天后,与Ad EGFP相比,Ad CBS组CBS蛋白增加了83%。此外Ad CBS组H2S水平也显著高于Ad EGFP组(114±7.5 versus 73.1±5.6,pg/mg;P<0.05)。2基因转染前后,测定了各组大鼠清醒状态的SBP和HR,Ad CBS组与Ad EGFP组组间无差异。3显微注射实验前对RVLM进行功能定位,单侧RVLM微量注射L-谷氨酸后,观察到血压升高20~30mm Hg,提示注射部位确实为RVLM。Ad CBS组RVLM区显微注射HA后,RSNA,MAP和HR均升高,但Ad CBS组的升高幅度大于Ad EGFP组。(RSNA:21.3±3.7%versus 14.2±3.2%;MAP:17.0±2.1 versus 9.7±1.3;mm Hg;HR:24.6±4.2 versus 14.7±3.1;bmp;P<0.05)。Ad EGFP与未处理组,RSNA,MAP,HR升高的幅度组间无差异。为了判定是否内源性的H2S介导的抑制效果依赖于KATP通道,我们在注射HA之前,预先注射了KATP通道激动剂,pinacidil。预先注射pinacidil15分钟后,RVLM区再微量注射HA。无论是Ad CBS组还是Ad EGFP组,预先注射的pinacidil可以完全取消HA的效果。为了判定KATP通道是否参与了在Ad CBS组RVLM区注射HA对RSNA,MAP和HR的增强机制,我们在RVLM区注射了Gli。在Ad CBS组,RVLM区显微注射Gli,诱发了RSNA,MAP和HR的增加(change in RSNA:11.4±2.1%;change in MAP:14.1±2.7 mm Hg;change in HR:22.7±2.7 bpm,P<0.05)。相反,Ad EGFP组,RVLM区显微注射Gli没有引起RSNA,MAP和HR的显著性改变(change in RSNA:4.2±2.1%;change in MAP:4.5±1.2mm Hg;change in HR:6.1±1.3 bpm,P<0.05)。4在基因转染后的第七天,我们检测了Kir6.1,Kir6.2,SUR1和SUR2蛋白表达。结果显示在Ad CBS组Kir6.1和SUR2蛋白表达升高,而SUR1和Kir6.2并没有发生显著改变。结论:尽管RVLM过表达CBS并没有影响SBP和HR,但是和Ad EGFP组相比,在Ad CBS组RVLM区显微注射CBS抑制剂所诱发的RSNA,MAP和HR的增加幅度明显增强。预先注射KATP通道激动剂,HA的效果被取消;注射KATP通道阻断剂,Ad CBS组RSNA,MAP和HR均升高,而Ad EGFP组各变量没有显著改变,并且RVLM区增加了Kir6.1和SUR2蛋白表达。这些结果提示RVLM区增加的KATP通道可能为Ad CBS组RVLM区显微注射CBS抑制剂所导致的增强的升压反应负责。这些发现提示CBS/H2S系统可能是某些交感神经活动增强疾病心血管基因治疗的重要靶点。第三部分RVLM区CBS/H2S系统对自发性高血压大鼠心血管活动的调控目的:SHR交感神经过度激活。RVLM区对心血管的调控有重要的作用。在我们的实验中,和WKY大鼠相比,SHR的RVLM区的CBS蛋白和H2S含量均降低。这些研究结果提示RVLM区CBS/H2S系统可能与交感神经过度激活有关。因此,我们推测CBS/H2S系统可能在SHR的交感神经过度激活和血压升高中起重要作用。越来越多的实验表明H2S和NO相互作用调节着心血管的功能。另外,SHR的RVLM区的NO介导交感抑制效果明显减弱,因此我们猜测,H2S在SHR RVLM区对交感神经的调控作用可能是通过CBS/H2S系统和NOS/NO系统相互作用实现的。所以,我们通过在RVLM区过表达CBS来证明这个假说。该研究有望阐明SHR RVLM中的CBS/H2S系统在交感神经激活机制中的作用及其关键靶点,为防治原发性高血压奠定理论基础,提供新思路。方法 :利用基因过表达的方法,将Ad CBS转染到RVLM区,观察RVLM增加的CBS/H2S系统对SHR清醒状态下SBP,HR和RSNA的影响;应用核团显微注射的方法,RVLM区显微注射L-NMMA,观察SHR RVLM区CBS/H2S系统对NOS/NO系统的影响;Western blot等方法检测RVLM区NOS/NO系统的的表达情况,并探讨与RVLM区CBS/H2S系统与NOS/NO系统之间的相互关系。结果1CBS基因转染7天后,RVLM区CBS表达增加到最大值。另外,在基因转染的第七天,Western blot结果显示,SHR+Ad EGFP组RVLM区CBS蛋白表达明显低于WKY+Ad EGFP组。Ad CBS组RVLM区CBS蛋白的表达明显高于Ad EGFP组和未处理组。然而,在SHR+Ad CBS组和WKY+Ad CBS组之间,CBS蛋白表达没有差异。我们在基因过表达后的第7天也检测了H2S的含量。Ad CBS组的H2S的含量明显高于Ad EGFP组。SHR+Ad EGFP组H2S的含量明显低于WKY+Ad EGFP组。WKY+Ad CBS和SHR+Ad CBS组H2S含量组间无差异。2在清醒状态下,我们测定了各组大鼠的SBP和HR。在RVLM区CBS基因转染后的第5天到第10天,SHR的SBP和HR明显升高,但是WKY组没有改变。Ad EGFP组SBP和HR和未处理组组间无差异。在基因转染前,SHR 24小时尿中的去甲肾上腺素水平明显高于WKY组。在基因转染后的第7天,SHR+Ad CBS组的尿中去甲肾上腺素水平明显高于SHR+Ad EGFP组。然而,在基因转染前后,WKY+Ad EGFP组和WKY+Ad CBS组尿中的去甲肾上腺素水平没有差异。3为了验证过表达CBS是否上调了NOS/NO系统,我们检测了RVLM区NOS蛋白和NOx的水平。SHR和WKY组RVLM区n NOS蛋白表达没有显著差异。然而,SHR+Ad CBS组RVLM区n NOS蛋白表达量明显降低,和SHR+Ad EGFP相比。WKY组组间无差异。ENOS和i NOS各组组间无差异。在SHR NOx水平明显低于WKY组,并且CBS基因转染后,NOx水平进一步下降,但是NOx在WKY组组间没有发生变化。4和WKY+Ad EGFP相比,SHR+Ad EGFP的GABA的水平明显降低。基因转染后,SHR+Ad CBS组GABA的水平进一步降低,WKY+Ad EGFP组和WKY+Ad CBS组组间无差异。5在基因转染后的第7天,各组RVLM区显微注射L-NMMA导致了RSNA,动脉血压(arterial blood pressure,ABP)和HR的升高。在SHR+Ad EGFP组RVLM区显微注射L-NMMA诱发的升压反应明显钝化,和WKY+Ad EGFP组相比。另外,SHR+Ad CBS组L-NMMA所诱发的升压反应的幅度明显低于SHR+Ad EGFP组,但是WKY组组间无差异。RVLM区显微注射人工脑脊液(100 n L),RSNA,ABP和HR没有发生改变。结论:当前的研究表明SHR的RVLM区过表达CBS增加了SBP,HR和尿中的去甲肾上腺素水平。这些效果可能被NOS/NO系统介导。这些结果提示CBS/H2S系统和NOS/NO系统之间的相互作用影响了过度兴奋的交感神经活动,并且SHR RVLM区减少的CBS蛋白可能是一个重要的补偿机制,目的是为了对抗下调的NOS/NO系统,进而抑制血压的进一步升高。这些结果为SHR的RVLM区血压调控的中枢机制提供了新的视角。