目的：　　 哮喘是由于气道暴露于各种抗原及化学刺激物所引起的慢性炎症。慢性气道炎症及气道高反应性是哮喘的主要特征。目前对于哮喘的治疗大多集中于抑制哮喘气道炎症及减轻气道高反应性。糖皮质激素对于哮喘治疗是一线类药物,但是其不能完全控制哮喘,因此,对于哮喘发病机制的研究有利于探讨哮喘治疗的新途径。目前对于哮喘发病机制的研究大多集中于免疫机制、气道平滑肌及气道上皮功能的研究。近几年感觉神经肽及其受体与哮喘关系的研究日益被引起关注。目前认为与哮喘关系较为密切的感觉神经肽有P物质(Substance P,SP)、神经激肽A(Neurokinin A,NKA)、神经激肽B(Neurokinin B,NKB),通过相应的NK-1R、NK-2R、NK-3R发挥作用。尚云晓等在小儿哮喘临床及哮喘动物模型上研究证实哮喘患儿血浆及哮喘豚鼠血浆、气管灌洗液、气道组织中SP含量均显著增加,哮喘豚鼠气道组织中SPmRNA表达较正常豚鼠明显上调,均与病情呈正相关。但是对于感觉神经肽受体在哮喘气道的表达及其受体拮抗剂对哮喘气道作用的研究甚少。因此,本文通过制作哮喘大鼠模型以探讨感觉神经肽受体NK-1R在哮喘气道的表达及其受体拮抗剂对哮喘气道的影响,为哮喘的治疗提供新的理论依据。　　 气道平滑肌细胞在哮喘气道是一种重要的效应细胞,其受气道内各种因素,尤其是各类免疫细胞所释放的细胞因子和炎性介质的调节,产生相应的收缩反应,调节气道的口径,从而影响呼吸功能。在持续哮喘的病例中,ASMC在细胞外基质、各种细胞因子、炎症因子和生长因子的作用下,ASMC会出现迁移性生长的现象。因此,气道平滑肌细胞对于哮喘的发生、发展及预后起到重要的作用。感觉神经肽P物质有刺激气道平滑肌细胞增殖、迁移的作用。但是对于P物质受体拮抗剂对气道平滑肌细胞增殖、迁移作用的研究甚少,因此,本试验通过对哮喘大鼠研究以探讨感觉神经肽P物质及其受体在气道平滑肌细胞表达分布的基础上,通过P物质受体拮抗剂干预原代培养大鼠气道平滑肌细胞,以说明P物质受体拮抗剂对气道平滑肌细胞增殖、迁移的影响。　　 气道平滑肌细胞的生物活性是通过细胞内钙离子浓度的改变来完成的。气道平滑肌细胞内钙离子浓度的改变与哮喘慢性气道炎症及气道高反应性密切相关。细胞内钙离子浓度是通过肌浆网钙ATP-酶(SERCA)、IP3R及RyR离子通道来完成的。哮喘气道平滑肌细胞SERCA2表达减少与细胞内钙离子浓度增高有关。P物质受体NK-1R属G蛋白偶联受体,SP与NK-1R结合后,通过G蛋白与磷脂酰肌醇二磷酸(PIP2)第二信使系统相联系,并通过三磷酸肌醇(IP3)作用于膜上的钙离子通道,引起膜电位的去极化和蛋白激酶活性的改变,从而发挥其生物功能。目前,对于感觉神经肽受体拮抗剂对于哮喘气道平滑肌细胞内钙浓度及肌浆网钙-ATP酶影响的研究甚少,因此,本实验通过荧光检测细胞内钙浓度成像系统及real-time PCR及westen-blot检测SERCA2/IP3R表达以说明P物质受体拈抗剂对气道平滑肌细胞内钙离子浓度的影响。　　 材料与方法：　　 1、大鼠哮喘模型的制作:　　 按照Wistar大鼠哮喘模型制作哮喘模型,即第一天及第七天腹腔注射1％卵蛋白1mg、1％氢氧化铝凝胶及6×109/ml百日咳灭活杆菌共1ml致敏,第15天开始雾化吸入1％卵蛋白诱喘7天。将45只Wistar大鼠随机分成正常对照组、哮喘组、普米克令舒治疗组。用卵蛋白雾化吸入制作哮喘大鼠模型。普米克令舒治疗组吸入卵蛋白诱喘后给予普米克令舒吸入治疗。　　 2、标本采集:　　 造模第21天取材,每组大鼠于末次激发24h内腹腔注射1％戊巴比妥钠麻醉,进行左肺肺泡灌洗。右肺中叶置于4％多聚甲醛用于HE和免疫组化染色。剩余气管及肺组织-80℃冰箱保存用于抽提总RNA、抽提蛋白。　　 3、支气管及肺组织病理学检测:免疫组化图像分析检测NK-1R表达组间差异。　　 4、大鼠气道平滑肌细胞原代培养:用酶消化法原代培养,差速贴壁法纯化ASMC,第4代的ASMC用于实验。　　 5、Real-time PCR检测体外培养纯化的第4代细胞NK-1RmRNA表达差异。　　 6、免疫细胞化学检测气道平滑肌细胞NK-1R表达。　　 7、四甲基偶氮唑蓝显色法(MTT)检测NK-1R拮抗剂对IL-13诱导气道平滑肌细胞增殖的影响;流式细胞仪检测ASMC细胞周期变化。　　 8、Transwell小室检测NK-1R拮抗剂对气道平滑肌细胞迁移的影响。　　 9、荧光检测细胞内钙浓度成像系统分析不同组气道平滑肌细胞内钙离子浓度变化及NK-1R拮抗剂对哮喘气道平滑肌细胞内钙离子浓度的影响。　　 10、RT-PCR及Westen-blot检测各组气道平滑肌细胞SERCA2/IP3R表达差异。　　 结果：　　 1、OVA激发时可见到大鼠咳嗽、呼吸困难、喘息。哮喘组支气管肺泡灌洗液(BALF)中白细胞计数及嗜酸粒细胞百分比较对照组大鼠明显增加;ELISA检测哮喘模型组大鼠血浆中IgE水平较正常组明显增高,差异显著(P＜0.05);HE染色提示哮喘组大鼠肺组织中支气管和血管周围肥大细胞、嗜酸性粒细胞、支气管上皮杯状细胞均较正常大鼠肺组织中增加。哮喘组大鼠血浆IL-13水平较正常组明显增高,差异显著(P＜0.05);哮喘组大鼠血浆IFN-γ水平较正常组降低,差异显著(P＜0.05);以上提示哮喘模型制作成功。　　 2、免疫组化图像分析NK-1R表达于气道平滑肌细胞胞浆;普米克令舒治疗组大鼠气道NK-1R表达平均光密度值较哮喘组降低,差异有统计学意义(P＜0.05);与正常组比较差异无统计学意义(P＞0.05)。　　 3、Real-Time PCR检测各组大鼠气道平滑肌细胞NK-1RmRNA相对含量提示普米克令舒治疗组气道平滑肌细胞NK-1RmRNA表达明显较哮喘组降低,差异有统计学意义;但较正常对照组增高,差异有统计学意义(P＜0.05)。　　 4、NK-1R拮抗剂对IL-13介导的ASMC增殖有抑制作用,48及72 h组间差异有统计学意义。　　 5、NK-1R拮抗剂对大鼠气道平滑肌细胞的迁移有抑制作用,24 h组间差异有统计学意义。　　 6、哮喘大鼠气道平滑肌细胞内钙离子浓度较正常组增高;NK-1R拮抗剂干预组气道平滑肌细胞内钙离子浓度降低。　　 7、Real-time PCR检测NK-1R拮抗剂干预组哮喘气道平滑肌细胞SERCA2表达较哮喘组增高,差异有统计学意义(P＜0.05);NK-1R拮抗剂干预组哮喘气道平滑肌细胞IP3R表达较正常组比较无统计学意义(P＞0.05);哮喘组ASMCSERCA2表达与正常组比较降低,差异有统计学意义(P＜0.05);哮喘组ASMC中IP3R表达与正常组比较无统计学意义(P＞0.05);NK-1R拮抗剂干预组哮喘气道平滑肌细胞IP3R表达较哮喘组降低,差异有统计学意义(P＜0.05)。　　 结论：　　 1、NK-1R参与哮喘的发病机制。普米克令舒通过降低哮喘大鼠气道内NK-1R表达来参与抑制哮喘气道神经源性炎症。　　 2、NK-1R拮抗剂通过抑制气道平滑肌细胞增殖、迁移来抑制哮喘气道重构。　　 3、NK-1R非肽类特异性受体拈抗剂通过提高肌浆网膜上SERCA2表达及降低IP3R表达从而降低细胞内钙离子浓度抑制哮喘气道炎症改善哮喘气道高反应。