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脓毒症是临床最常见的急危重症之一,流行病学结果显示2020年全球感染脓毒症患者人数高达4890万人,死亡率高达25-30%,是人类健康的巨大威胁。肠道机械屏障由单层上皮细胞组成,是机体吸收营养和抵御外界刺激的重要屏障,脓毒症后肠屏障功能严重受损,可导致肠道内菌群和毒素移位入血,引发严重组织损伤,目前治疗手段有限。肺脏无时无刻都在发生血气交换,在脓毒症早期即会发生损伤,血管渗漏是肺损伤的典型病理生理过程,可导致组织水肿和器官功能障碍,目前缺乏有效的治疗手段。微囊泡（microvesicles,MV）是一种细胞分泌的天然膜性囊泡,携带大量蛋白质、脂质、核酸等生物活性分子,可参与多种病理生理过程的调控。间充质干细胞微囊泡（mesenchymal stem cell-derived microvesicles,MMV）可携带大量干细胞来源的治疗性物质,如角质细胞生长因子、m RNA、mi R-292、mi R295等,在急性肾损伤、肾小球肾炎、白血病等多种疾病治疗方面发挥重要作用。MMV能否改善脓毒症后肠屏障及肺血管屏障功能,目前尚不清楚。脓毒症后,在多种损伤因素刺激下,肺血管内皮细胞也会分泌大量MV（endothelial microvesicles,EMV）,前期研究发现EMV可携带mi R-23b引起肺血管渗漏,其具体调节机制不详。MV的产生受到多种因素调节,抑制EMV产生是否能减轻其损伤作用,目前尚不清楚。为此,本研究利用盲肠结扎穿孔术（cecal ligation and puncture,CLP）复制大鼠脓毒症模型和脂多糖（lipopolysaccharide,LPS）刺激复制肠上皮细胞（intestinal epithelial cells,IEC-6）损伤模型,研究了MMV对脓毒症肠屏障功能的保护作用及机制,重点探讨了MMV递送mfn2、PGC-1α及功能性线粒体改善肠上皮细胞线粒体功能及屏障功能的机制。同时,我们研究了MMV对脓毒症肺血管屏障功能的保护作用及机制,重点探讨了MMV递送PKA及Wnt5a改善紧密连接及粘附连接的机制。最后,我们研究了阿米替林对脓毒症后EMV产生的抑制作用及对肺血管屏障功能的保护作用。研究内容:第一部分间充质干细胞微囊泡对脓毒症肠屏障功能的保护作用及机制1.间充质干细胞微囊泡对肠屏障功能的保护作用（1）脓毒症后肠屏障功能变化利用大鼠脓毒症模型及IEC-6细胞损伤模型,研究大鼠脓毒症后不同时相点肠道屏障功能变化,及IEC-6增殖及屏障功能变化,明确脓毒症后肠屏障的损伤特征。（2）MMV对脓毒症后肠屏障功能的保护作用MMV输注至脓毒症大鼠或与损伤IEC-6共孵育,研究MMV对大鼠肠屏障功能及对IEC-6屏障功能的作用,明确MMV对脓毒症后肠屏障功能的保护作用。2.间充质干细胞微囊泡通过改善线粒体功能恢复肠上皮细胞功能（1）MMV对IEC-6线粒体的保护作用MMV与损伤IEC-6共孵育,研究MMV对IEC-6内线粒体形态及数量、线粒体氧化磷酸化等功能的影响,明确MMV对线粒体的保护作用。（2）抑制氧化磷酸化对MMV保护作用的影响利用氧化磷酸化抑制剂2,4-二硝基苯酚与MMV共同处理IEC-6,研究抑制氧化磷酸化对MMV保护作用的影响,明确线粒体氧化磷酸化在MMV保护肠上皮功能中的作用。3.间充质干细胞微囊泡改善线粒体动力平衡的机制（1）MMV递送mfn2促进IEC-6内线粒体融合利用mfn2过表达及干扰病毒处理MSC,收集mfn2过表达及低表达的修饰MMV,并与损伤IEC-6孵育,研究MMV内mfn2对IEC-6线粒体融合功能的影响。（2）MMV递送PGC-1α促进IEC-6内线粒体生成利用PGC-1α过表达及干扰病毒处理MSC,收集PGC-1α过表达及低表达的修饰MMV,并与损伤IEC-6孵育,研究MMV内PGC-1α对IEC-6线粒体生成功能的影响。（3）MMV递送功能性线粒体改善IEC-6内线粒体功能利用透射电镜及流式,观察MMV内线粒体含量及功能;利用线粒体红色荧光质粒,观察MMV内线粒体与IEC-6内线粒体融合过程,明确MMV递送线粒体对IEC-6内线粒体功能的影响。第二部分间充质干细胞微囊泡对脓毒症肺血管屏障功能的保护作用及机制1.MMV对肺血管屏障功能的保护作用MMV输注至脓毒症大鼠及与损伤血管内皮细胞（vascular endothelial cells,VEC）共孵育,研究MMV对大鼠肺血管渗漏、肺损伤的保护作用。2.MMV蛋白组学分析利用蛋白质谱对MMV进行蛋白组学分析,使用KEGG及GO分析MMV内调节血管渗漏相关蛋白。3.MMV保护肺血管屏障功能的机制（1）MMV递送PKA保护肺血管屏障功能利用PKA激活剂、抑制剂及PKA-si RNA,研究MMV内PKA对VEC内VASP、ZO-1的作用,阐明MMV递送的PKA对肺血管屏障功能的保护作用及机制。（2）MMV递送Wnt5a保护肺血管屏障功能利用Wnt5a激活剂、抑制剂及Wnt5a-si RNA,研究MMV内Wnt5a对VEC内cdc42、VE-cadherin的作用,阐明MMV递送的Wnt5a对肺血管屏障功能的保护作用及机制。第三部分血管内皮细胞微囊泡在脓毒症肺血管屏障功能中的作用1.EMV递送mi R-23b在肺血管渗漏中的作用利用mi R-23b过表达及干扰质粒,研究EMV对肺血管渗漏的作用,阐明EMV对肺血管屏障功能的作用及机制。2.抑制EMV对肺血管屏障功能的保护作用利用阿米替林处理VEC,检测EMV生成变化;收集相应EMV刺激大鼠及与VEC,观察经阿米替林处理的EMV对肺血管屏障功能的影响。研究结果:第一部分间充质干细胞微囊泡对脓毒症肠屏障功能的保护作用及机制1.间充质干细胞微囊泡对肠屏障功能的保护作用大鼠脓毒症后肠屏障功能严重受损,MMV输注可显著改善大鼠肠屏障功能,恢复肠上皮细胞增殖、屏障功能。2.间充质干细胞微囊泡通过改善线粒体功能恢复肠上皮细胞增殖及屏障功能MMV可改善IEC-6内线粒体动力平衡,从而改善线粒体膜电位及氧化磷酸化。抑制线粒体氧化磷酸化会抑制MMV对IEC-6的保护作用,提示线粒体动力平衡及氧化磷酸化在MMV保护IEC-6功能中发挥重要作用。进一步发现MMV可通过促进GOT1表达,恢复线粒体代谢中间产物天冬氨酸含量,提示天冬氨酸可能在MMV保护IEC-6功能中发挥重要作用。3.间充质干细胞微囊泡改善线粒体动力平衡的机制（1）MMV可携带线粒体融合蛋白mfn2并递送至IEC-6,通过促进线粒体融合改善线粒体动力平衡,恢复线粒体氧化磷酸化,从而改善IEC-6屏障及增殖功能。（2）MMV可携带线粒体生成蛋白PGC-1α并递送至IEC-6,通过促进线粒体生成改善线粒体动力平衡,恢复线粒体氧化磷酸化,从而改善IEC-6屏障及增殖功能。（3）MMV内可携带具有呼吸功能的线粒体并递送至IEC-6,与IEC-6内线粒体融合,直接改善IEC-6内线粒体功能。MMV内PGC-1α可增加MMV内线粒体含量,促进IEC-6内线粒体功能恢复。第二部分间充质干细胞微囊泡对脓毒症肺血管屏障功能的保护作用及机制1.MMV对肺血管屏障功能的保护作用MMV可改善大鼠肺血管渗漏及肺湿干重,减轻肺损伤,恢复VEC屏障功能;MMV还可改善大鼠动脉血气指标,提升大鼠存活率,延长存活时间。2.MMV蛋白组学分析使用KEGG及GO分析MMV内蛋白质谱结果,34种血管渗漏相关蛋白高表达,其中PKA与Wnt5a与血管渗漏调节密切相关,进一步发现MMV内可携带PKA及Wnt5a,可能对肺血管屏障功能的保护密切相关。3.MMV保护肺血管屏障功能的机制（1）MMV可递送PKA至VEC,通过促进VASP磷酸化从而招募ZO-1至细胞膜,恢复紧密连接功能,从而改善肺血管屏障功能。（2）MMV可递送Wnt5a至VEC,通过促进cdc42表达从而恢复VE-cadherin在细胞膜上的表达,恢复粘附连接功能,从而改善肺血管屏障功能。第三部分EMV在脓毒症肺血管屏障功能中的作用1.EMV递送mi R-23b在肺血管渗漏中的作用EMV可递送mi R-23b至VEC,通过与ZO-1 m RNA 3’UTR端结合从而抑制ZO-1表达,破坏紧密连接结构,导致肺血管屏障功能损伤。2.抑制EMV对肺血管屏障功能的保护作用阿米替林可显著抑制EMV产生,从而减轻EMV导致的肺血管渗漏及肺损伤,实现对肺血管屏障功能的保护。结论:1.脓毒症后肠屏障功能严重受损,MMV可递送mfn2、PGC-1α及功能性的线粒体至肠上皮细胞,通过恢复线粒体动力平衡,改善线粒体氧化磷酸化及代谢,从而恢复肠上皮细胞屏障及增殖功能,实现对肠屏障功能的保护。2.MMV可递送PKA及Wnt5a至血管内皮细胞,一方面通过PKA促进VASP磷酸化,促进ZO-1的募集从而改善紧密连接,另一方面通过Wnt5a促进cdc42生成,恢复VE-cadherin表达从而改善粘附连接,共同保护肺血管屏障功能。3.EMV可递送mi R-23b至血管内皮细胞,通过抑制ZO-1表达从而引起肺血管渗漏及肺损伤。阿米替林可减少EMV释放及其诱导的肺损伤,从而实现对肺血管屏障功能的保护。