蒙古黄芪异黄酮合成酶基因的克隆及序列分析

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异黄酮是一类植物次生代谢物质,具有独特的保健功能及防治多种疾病的作用。随着分子生物学和次生代谢工程研究的深入,异黄酮的合成代谢途径已经比较清楚,而且已经从大豆(Glycine max)、鹰嘴豆(Cicer arietinum)、豌豆(Pisum sativum)等植物上分离了一些异黄酮合成代谢途径的关键酶基因。 异黄酮合成酶是苯丙氨酸分枝代谢途径—异黄酮代谢途径的关键酶。为了进一步对异黄酮合成酶基因进行研究,本研究采用cDNA末端快速扩增(Rapid Amplification of cDNA ends,RACE)技术,首次从中国特有的药用植物蒙古黄芪(Astragalus membranaceus(Fisch.)Bge.var.Mongholicus(Bge.)Hsiao)种子发芽的根中分离克隆得到一个新的异黄酮合成酶基因,对该基因进行了序列分析和功能预测,为今后研究该基因的功能、分子进化及次生代谢工程等奠定了基础。具体的实验结果如下: 用还原型谷胱甘肽处理蒙古黄芪根部,诱导异黄酮合成酶基因表达,提取总RNA。采用同源克隆方法,首先利用RT-PCR技术得到了673bp的序列:再通过RACE技术获得长度为1,995bp的异黄酮合成酶基因,并命名为mhifs。mhifs包含一个完整的开放阅读框(1,578bp),编码525个氨基酸,推导肽链的分子量约为60kDa。经同源查找,通过相关的生物信息学分析,在核苷酸水平上,蒙古黄芪异黄酮合成酶基因全长cDNA序列与大豆、鹰嘴豆、豌豆、刺甘草(Glycyrrhiza echinata)异黄酮合成酶基因分别有82%、84%、82%、83%的相似性;在氨基酸水平上,蒙古黄芪异黄酮合成酶与大豆、鹰嘴豆、豌豆、刺甘草异黄酮合成酶的氨基酸序列分别有80%、83%、79%、83%的相同性和88%、89%、87%、88%的相似性。对其进行氨基酸保守区域分析,结果表明它与其它豆科植物的异黄酮合成酶一样都含有3个保守区域。综上所述,推测mhifs具有异黄酮合成酶基因的功能。
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