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先天性肢端畸形是人类最常见的出生缺陷之一，在新生儿中的发生率为1‰—2‰。引起先天性肢端畸形的原因有环境因素和遗传因素两大类。环境因素主要包括病毒感染、电离辐射、化学致畸剂、不良的子宫内环境和母体的代谢性疾病等，例如，孕妇在妊娠早期服用反应停所导致的海豹肢就是环境因素引起肢端畸形的典型示例。遗传因素主要指基因突变或染色体畸变，其导致的肢端畸形既可单独发生又可是某种综合征的一部分。多种基因突变和染色体畸变都会直接引起肢端形态发生（morphogenesis）的异常，表现不同类型的肢端畸形，如并指（趾）（syndactyly，SD）、短指（趾）（brachydactyly，BD）和缺指（趾）（ectrodactyly）畸形属于形态发生不完全的结果，多指（趾）畸形则是形态发生过程中附加组织形成的结果。而以远端关节挛缩畸形（distal arthrigryposis，DA）为代表的另一大类肢端畸形，其直接原因并不是形态发生的异常，而是关节、肌肉等功能缺陷的继发表现。本文利用分别属于上述两大类肢端畸形的五个中国人家系为研究对象，进行了致病基因染色体定位、基因突变鉴定和突变基因功能初步分析等系列研究工作。论文一并指（趾）和短指（趾）畸形中HOXD13基因突变研究SD是由于指（趾）间骨性或软组织融合形成的肢端畸形。BD是由于指（趾）骨和掌（跖）骨短小、缺失或融合导致的手足短小畸形。同样，SD和BD既可单独发生又可是某种综合征的一部分。根据受累部位的解剖学特征，非综合征型SD可分为Ⅰ-Ⅴ五种类型，非综合征型BD被分为A-E五种类型。其中，BDA和BDE又可分为若干亚型。现已知，HOXD13和GJA1分别是Ⅱ型和Ⅲ型SD的致病基因。IHH、BMPR1B、ROR2和GDF5基因突变分别可致BDA1、BDA2、BDB和BDC。同时，携带GDF5基因突变的个体也可表现BDA2。HOXD13基因含2个外显子，编码蛋白包括335个氨基酸。其中，外显子1编码的蛋白N-端含一个由15个丙氨酸残基组成的多聚丙氨酸（polyalanine）链，外显子2编码C-端的同源异形结构域（homeodomain，HD）。Ⅱ型SD又称并多指（趾）（synpolydaetyly，SPD），由HOXD13基因多聚丙氨酸延展（polyalanine expansion，PAE）等突变引起。HOXD13基因点突变引起HD内氨基酸替代时可导致BDD和BDE。因此，HOXD13单一基因内不同突变可以是不同类型肢端畸形发生的遗传基础。本文在三个肢端畸形大家系进行了HOXD13基因致病基因的鉴定研究。家系1中患者手部畸形特征表现为4-5掌骨融合，其它主要表现为2-5指尺侧偏位及远节指骨短小、3-4或4-5并指、第5指短小或弯曲、屈指和中远指节间关节褶消失；足部畸形共同表现为：趾骨外翻，跖骨内翻，第1趾（跖）骨粗大，第2-5趾（跖）骨发育不良，第5趾（跖）骨短。以上手足畸形表型与Robinow等报道的Ⅴ型SD一致。家系2中患者畸形仅限于手足，手足骨骼普遍都缩短，属于兼有BDA4，BDD和BDE表型的复合型BD。突出的表现是全部患者双足2-5趾中节趾骨缺失，双手2-5指中节指骨短小或与远节指骨融合，但以第5指、第2和5指中节指骨受累最多。部分患者拇指远节指骨粗短；3-5掌（跖）骨全部或部分短小畸形：拇趾粗大、趾骨宽短；3-4指或2-3趾间软组织轻度并指（趾）。家系3为一典型的SPD家系，患者主要临床表现为3-4并指及4-5并趾，蹼中的第4指及第5趾部分或完全多指（趾）。首先在染色体2q24.3-q31.3区段HOXD13基因内部及基因两侧选取6个多态信息量高的微卫星标记，采用LINKAGE软件包中的MLINK程序计算遗传标记与致病基因所在的疾病基因座（disease locus）间的LOD值，对家系1进行两点连锁分析。结果表明：致病基因与上述微卫星标记存在紧密连锁关系，在D2S2314标记获得最大LOD值，为4.90（θ=0.00）。单体型分析显示：家系1中SD表型与5个标记（D2S2981、HOXD13、D2S2314、D2S324和D2S1391）共分离。我们前期对家系2进行的两点连锁和单体型分析，已得到BD表型与3个标记（D2S2981、HOXD13和D2S2314）共分离的数据资料。在此基础上，我们通过PCR扩增HOXD13基因外显子及外显子／内含子交界区，PCR产物直接测序或克隆测序，在上述三个家系中进行了致病基因突变鉴定研究。结果表明：三个家系中不同肢端畸形都由HOXD13基因的杂合突变所致。其中，ⅤSD家系中致病突变为c.950A＞G（p.Gln317Arg），突变导致HOXD13蛋白HD内第50位氨基酸由谷氨酰胺（Gln）变为精氨酸（Arg）；复合型BD家系中致病突变为c.160-180delGCGGCGGCTGCGGCGGCGGCG（p.Ala54Ala60del），突变导致HOXD13蛋白7个丙氨酸（Ala）缺失，为多聚丙氨酸缩短（polyalanine contraction，PAC）；SPD家系中致病突变为c.172198dupGCGGCGGCGGCGGCAGCGGCGGCTGCG（p.Ala58-Ala66dup），导致HOXD13蛋白9个Ala重复，属于常见的PAE。通过PCR产物限制性内切酶分析或／和PAGE分析验证上述三种HOXD13基因突变，发现在相应的家系中突变见于全部患者而未见于正常家系成员。在100名和124名无关正常个体中分别检测p.Gln317Arg和p.Ala54Ala60del突变，结果均为阴性。特别值得提及的是，HOXD13蛋白第317位Gln是其结合DNA的关键氨基酸之一，迄今为止已知的HOX蛋白家族全部成员在HD第50位氨基酸都是Gln。以上结果和数据强烈提示，p.Gln317Arg和p.Ala54Ala60del两种突变为致病突变。通过单体型分析和突变直接检测，在家系1和3中分别完成了1例和2例高危胎儿的产前诊断。为进一步在探讨HOXD13基因PAC和PAE突变的致病机制，分别以上述BD和SPD患者基因组DNA为模板，通过PCR扩增、基因合成和基因克隆等方法构建野生型和突变型HOXD13基因的GFP-融合蛋白表达载体。进一步在HeLa和COS-7细胞中进行瞬时表达，发现：PAC突变体与野生型相同，GFP-HOXD13融合蛋白分布于细胞核中；PAE突变体的GFP-HOXD13融合蛋白定位于细胞核和细胞质。这一现象提示：PAC突变不同于PAE突变，对HOXD13蛋白入核无明显影响。由此可以推测，HOXD13基因PAC和PAE两类突变通过不同机制引起表型截然不同的BD和SPD。总之，通过上述研究，我们发现了Ⅴ型SD的致病基因，首次证明HOXD13基因PAC突变能引起BDA4／BDE／BDE畸形，首次在中国人SPD家系中检测到HOXD13基因PAE突变。我们的研究结果为HOXD13基因突变相关肢端畸形表型谱增添了新的内容。论文二远端关节挛缩畸形中TNNI2和TPM2基因突变研究源于肌肉和关节等功能缺陷的先天性肢端畸形以远端关节挛缩畸形（distal arthrogryposis，DA）最为常见，在新生儿中的发生率约为1／3000。DA患者主要临床表现为对称性或非对称性的叠指、屈指、2-5指尺侧偏位；马蹄内翻足、垂直距骨和扁平足等畸形。此外，DA还可伴随颜面、身高、脊柱和皮肤纹理等异常。根据有无颜面等畸形，DA可分成10种亚型。其中，DA1为单纯的手足关节挛缩畸形；DA2A除手足关节挛缩畸形外还兼有微小嘴、“H”形颊窝、鼻唇褶明显、人中长、小鼻子、睑裂狭小、眼距宽大伴眼睛深陷和脊柱侧凸等；DA2B表型介于DA1和DA2A之间，除手足关节挛缩畸形外，可有三角脸、睑裂下斜和小嘴等颜面部表现。国外研究表明，编码快速收缩肌纤维蛋白的三个基因TPM2（定位于染色体9p13）和TNNI2／TNNT3（定位于染色体11p15）的点突变可分别导致DA1和DA2B。我们收集到两个符合DA2B诊断标准的DA家系并进行了致病基因突变鉴定研究。家系1为七代，包括32名患者，具有DA2B的典型手足和颜面表现，但家系内患者表型变异明显，3名患者有脊柱侧凸（其中2名伴先天性髋脱位）。家系2三代共3名患者，1名患者有DA2B的典型的手足和颜面表现，其余2名患者仅有手足关节挛缩畸形，全部患者都表现身材矮小。我们首先通过UCSC人类基因组数据库，在候选基因TPM2、TNNI2/TNNT3和TNNC2附近选择微卫星序列9p13AAC、11p15CCT、11p15GT和20q13AC，自行设计PCR引物在家系中进行两点连锁分析和等位基因共享分析。在家系1中，11p15CCT显示最大LOD值，在θ=0时为3.91，9p13AAC和20q13AC的LOD值在θ=0时都为-∞；在家系2中，仅9p13AAC存在等位基因共享，呈正LOD值（θ=0时为0.91）。以上结果提示：家系1中致病基因可能为TNNI2或TNNT3；家系2中致病基因可能为TPM2。进一步在家系1中进行TNNI2基因编码区的PCR扩增和测序，发现一个涉及三个碱基的微小缺失突变，即c.523 525delAAG。该突变导致肌钙蛋白I的175位赖氨酸缺失（p.Lys175del）。家系中全部患者都携带此突变，而在正常家系成员和50名无关正常对照个体中都未检测到此突变。通过NCBI／BLAST进行同源序列比对分析，发现175位赖氨酸为所有肌钙蛋白I中高度保守的氨基酸。因此，我们认为c.523525delAAG（p.Lysl75del）为致病突变。在家系2中进行TPM2基因测序，发现所有患者为c.308A＞G（p.Gln103Arg）错义突变的杂合子。通过PCR产物限制性内切酶分析验证，确认正常家系成员和65名无关正常对照个体中均无此突变。同样，TPM2基因c.308A＞G（p.Gln103Arg）突变改变了β-原肌球蛋白中高度保守的氨基酸。所以，该突变也应该为致病突变。综上所述，我们首次在中国人DA2B家系中检出TNNI2基因致病突变，发现TPM2基因突变亦导致DA2B。本文在中国人DA2B家系中发现两个新的致病突变，进一步证明了DA2B的遗传异质性。