目前,病毒性肝炎、酒精性肝病、非酒精性脂肪肝、缺血-再灌注肝损伤、药物性肝病、肝癌等肝脏疾病已成为世界公共健康问题。研究证实,氧化应激通过影响酶类及受体的功能,破坏细胞膜完整性,影响细胞保护基因的表达,干扰肝脏的氧化-还原稳态,从而参与多种肝脏疾病的病理生理过程。氧化应激损伤临床常采用维生素A、β-胡萝卜素、维生素E、维生素C、GSH等还原性物质进行抗氧化治疗。但近年发现,NO、H2O2等多种自由基是细胞内重要的信号转导分子,化学药物在清除过量有害自由基的同时亦会影响自由基作为信号分子的正常生理功能。因此,寻找增强肝细胞内源性抗氧化能力,促进氧化-还原稳态恢复的药物,有望成为氧化性肝损伤的有效治疗手段。研究显示,Keap1-Nrf2-ARE信号通路参与氧化性肝损伤修复过程中细胞保护基因的转录调控。由于该信号通路具有调节细胞内源性抗氧化系统的特点,研究该通路的诱导剂,有望为实现适度、可控的氧化性肝损伤治疗开辟新的途径。植物黄酮能显著抑制病毒性肝炎、药物性肝病、肝癌等的发生发展,其机制可能与激活Keap1-Nrf2-ARE信号通路增强细胞内源性抗氧化能力有关,但其作用靶点尚待进一步阐明。金丝桃苷(Hyperoside, Hyp)属黄酮醇苷化合物,对缺血性脑损伤、心肌损伤、肝损伤及肾损伤均有显著保护效应,其机制主要为抗氧化。既往研究表明,Hyp除能直接清除ROS、螯合金属离子外,还可能增加GSH-Px、SOD、CAT等抗氧酶的活性,但对酶活性的这种调节作用是否是通过调控抗氧化基因的表达实现的,尚未明确。本研究拟以H2O2损伤的L02细胞为模型,在明确Hyp肝细胞保护效应的基础上,分析抗氧化酶活性增加与基因表达的关系,探讨Keap1-Nrf2-ARE信号通路在其中的调控作用。研究内容:1、建立测定L02细胞内外Hyp含量的HPLC方法,分别于加药后0, 3, 6, 12, 24 h分析细胞内外Hyp的含量。2、建立H2O2(100μM, 6 h)损伤的L02细胞模型,测定细胞活力、LDH泄漏百分比、MMP、ROS清除能力和抗氧化酶SOD、HO-1的活性,分析Hyp肝细胞保护效应的时效、量效关系。3、L02细胞以Hyp处理后,RT-PCR、Real-time RT-PCR分别用于分析Hyp对HO-1和Nrf2、Keap1 mRNA水平的影响;双荧光素酶实验分析Hyp对HO-1基因表达的诱导作用;WB分析Hyp对Nrf2、Keap1胞浆胞核蛋白含量、MAPK磷酸化和Bach1胞核内表达量的影响;IF分析Hyp对Nrf2核转位的影响。研究结果:1、成功建立测定L02细胞内外Hyp浓度的HPLC方法,方法专属性好,回收率、精密度高。随着孵育时间的延长,进入细胞内的Hyp量也逐渐增加。与细胞共培养24 h,细胞内的Hyp达峰值11.88%。2、Hyp (10-800μM)能明显减弱H2O2导致L02细胞活力下降、LDH泄漏百分比增加、MMP和ROS清除能力降低,且效应具有剂量依赖性。L02细胞经Hyp (10-800μM)预处理24h后,SOD、HO-1活性呈剂量依赖性地增加。时效研究结果显示,Hyp预处理1 h,细胞ROS清除能力短暂性减弱,HO-1活性显著增强,细胞活力变化不明显;Hyp预处理3 h,三者较正常正常对照组无显著差异,而后均逐渐增强。3、与正常对照组相比,Hyp能明显诱导HO-1 mRNA水平上升和蛋白表达量增加,且作用呈剂量依赖性和时间依赖性。Hyp处理后,L02细胞Nrf2 mRNA水平和蛋白表达量均显著上调,Nrf2核转位增加。Hyp对Keap1 mRNA的水平无明显调节作用。Hyp (200μM)处理细胞6 h和12 h,胞浆Keap1的表达量明显减少,而24 h后又恢复至正常水平。在相同的实验条件下,未见Keap1在胞核中表达。4、随着Hyp (200μM)与L02细胞孵育时间的延长,ERK、P38的磷酸化水平逐渐增加,而JNK的磷酸化水平变化不明显。ERK特异性抑制剂(PD98059)和P38特异性抑制剂(SB203580)均能显著抑制Hyp导致的Nrf2核转位,而JNK抑制剂(SP600125)对其无明显影响。5、Hyp (200μM)处理细胞3 h能明显减少胞核内Bach1的表达量,而出核抑制剂LMB能明显抑制Hyp的这种下调作用。结论:1、Hyp可进入L02细胞,且随着孵育时间的延长,细胞内Hyp的浓度逐渐增加,于给药后24 h达最大值。2、Hyp对H2O2损伤的L02细胞具有保护效应。3、Hyp的细胞保护效应与清除ROS的直接抗氧化作用有关。4、Hyp通过MAPK途径激活Keap1-Nrf2-ARE信号通路,诱导HO-1基因表达,是其发挥细胞保护效应的重要机制之一。5、Hyp促进Nrf2的胞核抑制分子Bach1转出细胞核是其诱导HO-1基因表达的另一机制。