成肌细胞是指含有肌丝的肌组织前体细胞,存在于胞浆中,具有自我更新、增殖、分化最终融合形成新肌纤维的再生能力。截至目前,成肌细胞移植已应用于杜氏肌营养不良和心肌梗塞等肌病的临床前研究,但治疗效果并不理想。有研究报道,宿主的免疫应激是导致成肌细胞移植后迅速死亡并制约其临床应用的关键因素之一。雷帕霉素作为免疫抑制剂可成功应用于成肌细胞的异体移植。然而,在肌损伤缺营养微环境条件下的作用机制目前仍不十分清楚。本课题首先通过血清饥饿处理模拟体内缺营养微环境,MTT实验体外评价雷帕霉素分别对处于增殖和分化阶段成肌细胞系C2C12活性的影响,并进一步通过分子生物学和细胞生物学手段揭示雷帕霉素对在饥饿处理条件下成肌细胞肌发生过程的作用机制。基于体外细胞实验结果,构建动物体内比目鱼肌损伤模型,在雷帕霉素和成肌细胞联合治疗作用下,开展体内动物损伤后肌肉再生修复的实验研究。1.MTT法检测七种不同浓度梯度(200ng/ml,150ng/ml,100ng/ml,50ng/ml,20ng/ml,10ng/ml和5ng/ml)雷帕霉素对饥饿和未饥饿处理的C2C12细胞增殖、分化期细胞活性的影响。值得注意的是,处于分化阶段的细胞,除200ng/ml浓度雷帕霉素作用外,细胞活性与正常对照组相比均无明显差异。考虑到成肌细胞治疗途径主要是通过体外大量扩增后回输至宿主体内肌肉损伤部位,因此,本课题筛选150ng/ml雷帕霉素拟作为理想最大免疫抑制浓度,进行肌发生过程的机制研究。2.研究雷帕霉素对饥饿预处理成肌细胞肌发生过程的影响及其作用机制。结果表明：(1)采用Annexin V-FITC/PI法流式分析研究发现雷帕霉素对成肌细胞有较好的保护免凋亡作用；(2)实时荧光定量分析发现雷帕霉素对肌源性调控因子(Myogenic regulatory factors, MRFs)和肌肉抑制素(Myostatin)的拮抗基因follistatin存在表达差异：a、无论饥饿处理与否,增殖期的成肌细胞中MyoD1和follistatin基因表达均较高于对照组,其中MyoD1基因达极显著水平(P<0.01),有利于细胞向肌源性分化的方向进行；b、对于分化期的成肌细胞,饥饿预处理和未经饥饿处理的正常分化细胞则呈现明显不同的表达差异,就未饥饿处理的正常分化细胞而言,雷帕霉素显著抑制对成肌细胞分化过程起重要作用的调节因子myogemn和MRF4基因的表达；然而,对于饥饿预处理细胞,myogenin和MRF4基因表达量相对增加,且在雷帕霉素作用下72h,对成肌细胞终末分化起重要角色的MRF4基因表达量明显上升,达极显著水平(P<0.01)；与此同时,促肌发生过程调节作用的follistain基因在饥饿预处理细胞中表达也相对较高,雷帕霉素作用72h表达量达极显著水平(P<0.01),有利于成肌细胞向肌发生过程且减少体内肌损伤纤维化的方向进行；(3)半定量RT-PCR时空表达分析发现,无论饥饿预处理成肌细胞与否,雷帕霉素对肌发生增殖和分化过程分别起重要调控作用的MAPK/ERK和PI3K/Akt信号通路与对照组相比均无明显差异；(4) Western-blot研究发现,饥饿预处理后,雷帕霉素作用48h能促进增殖期细胞中MyoD1蛋白表达,达极显著水平(P<0.01),这与前期荧光定量分析结果相一致；然而对分化期细胞的Myogenin蛋白与对照组相比虽有一定抑制效果,但差异不显著；信号通路蛋白研究发现,雷帕霉素对ERK和Akt蛋白表达存在显著性差异,但反映蛋白活性的pERK/ERK和pAkt/Akt与对照组相比均差异不显著,这与半定量表达结果相一致,因此,该浓度下雷帕霉素可作为成肌细胞异体移植潜在的免疫抑制剂量。3.通过细胞体外损伤修复实验,研究发现150ng/ml雷帕霉素不利于成肌细胞的迁移,这与前期MTT检测雷帕霉素抑制细胞增殖活性结果相一致,可能与雷帕霉素抑制mTOR信号通路有关,因此,雷帕霉素的长期作用会在一定程度上影响成肌细胞异体移植临床治疗肌病的效果。4.体外细胞融合实验研究表明,在饥饿处理条件下,雷帕霉素对肌管数目和肌管直径均有明显抑制作用,作为成肌细胞融合的重要指标融合指数也明显下降,差异均达到极显著水平(P<0.01)；这些结果表明雷帕霉素不利于肌损伤缺营养环境条件下成肌细胞治疗后期肌细胞融合。5.根据细胞贴壁效率不同,采用双酶消化法、Percoll浓度梯度离心和差速贴壁等一系列分离纯化手段从乳鼠中分离原代成肌细胞,结合成肌细胞中结蛋白特性,通过免疫组化法鉴定原代成肌细胞的纯度较高,证实该分离方法切实、可靠。6.通过心脏毒素构建肌肉损伤模型,结合体外研究结果,初步探讨了雷帕霉素作用下成肌细胞异体移植治疗肌损伤的效果。研究结果表明,雷帕霉素对成肌细胞异体移植治疗效果较明显,这与体外实验证实雷帕霉素具有保护成肌细胞分化活性和抑制细胞凋亡结果相一致。综上所述,在缺营养的肌损伤微环境中,雷帕霉素具有保护成肌细胞分化阶段活性和免于细胞凋亡的作用,初步揭示了雷帕霉素具有促成肌细胞定向分化潜能的作用机制。然而进一步研究发现,雷帕霉素也存在抑制细胞迁移和细胞融合的不利影响。因此,作为低毒、强效的免疫抑制剂,雷帕霉素的应用需要进一步通过后续的实验研究,更加科学、合理的应用于将来成肌细胞异体移植的临床治疗。