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背景和目的：肺鳞癌是一种致死率很高的肺癌类型,在所有肺癌中,其发病率仅次于肺腺癌。因治疗手段有限,晚期肺鳞癌的5年生存率不到15%。人类肺鳞癌的发生发展过程漫长,一般认为：正常的支气管黏膜假复层柱状上皮细胞受慢性刺激和损伤,正常纤毛丧失,出现不同程度的支气管上皮增生,随后可能发生不典型增生,鳞状上皮化生和发育不全,最后部分进展为原位癌及浸润性癌。提示若能阻止或逆转肺鳞癌发生前任意一环节的良性病变,都将有可能阻止肺鳞癌的最终发生。目前肺鳞癌转基因小鼠已逐渐应用于人肺鳞癌的研究,已知的构建方法主要有四种：Lkbl敲除/KrasGI2D过表达,IKKa死亡激酶敲入,Lkbl/Pten同时敲除和Sox2过表达/Lkbl敲除。尽管这些小鼠能发生肺鳞癌,但却存在肺癌类型混杂、潜伏期长、成瘤率低、仅能出现肺鳞癌却缺失与人肺鳞癌发生前类似的阶段性病理改变过程等缺点。并且,尽管肺鳞癌的发生与许多基因的同时突变有关,但驱动正常肺组织进展为肺鳞癌的启动基因仍未明确。因此,本课题组选取了三个与人肺鳞癌密切相关的基因,构建出转基因小鼠模型,以期寻找肺鳞癌的启动基因,并试图通过在小鼠肺内模拟与人肺鳞癌阶段性病变类似的过程,帮助临床肺鳞癌的诊断、治疗和预防。另外,目前认为,cytokeratin 5(K5)来源细胞是一类具有干细胞特性的细胞群,并可能与肺癌的发生有关。我们应用Cre-loxP系统,分别研究了K5特异性来源的细胞与非特异性来源的细胞在相同损伤及基因缺陷的背景下,是否都能在小鼠肺内形成肿瘤及形成肿瘤的区别,从而探讨K5来源细胞是否具有潜在的肺癌干细胞功能。方法：根据2012年Cancer Genome Atlas Research Network(TCCA)发布的178例人肺鳞癌标本基因分析数据和本课题组小鼠体外气道干细胞球气液相体系培养的结果(未发表数据),我们选择了NICD1,Lkb1和P53三个基因,利用Cre-loxP系统,构建出K5-CrePR;NICD1;P53;Lkbl转基因小鼠模型。分别通过Ru486诱导K5细胞特异性Cre重组酶表达或直接应用非细胞特异的Adenovirus Cre重组酶的方法,引起Notch通路重要因子NICD1的过度激活,并同时沉默抑癌基因Lkbl和P53在小鼠体内的表达。此后对转基因小鼠予以聚多卡醇肺损伤刺激,并长期观察小鼠,当小鼠出现异常状态或体征后,处死小鼠留取肺组织标本。首先,用H&E染色的方法,筛查肺部肿瘤的形成情况及初步判断肺部肿瘤的病理类型。随后,对于筛选得到的肺部肿瘤标本,用不同类型肺癌的特异性标记抗体进行免疫荧光染色,进一步判断肺部肿瘤的具体病理类型。最后,通过整理所有转基因小鼠的数据：1.总结各基因型小鼠的肺部病理特点,并分析各基因对肿瘤形成的作用；2.总结两种来源Cre重组酶对小鼠肺部肿瘤形成的异同,并分析K5来源细胞在肺部肿瘤形成中的作用。另外,我们还在第一部分实验中,初步探讨了K5来源细胞的干细胞功能：1.通过流式分选术及体外气道干细胞成球气液相体系培养的方法,观察Trop-2+ITGA6+气道干细胞(ABSCs)中是否富集K5来源干细胞。2.应用K5-CrePR-YFP转基因小鼠模型,通过K5-YFP+ve细胞的自身示踪,追踪K5来源细胞在博来霉素肺损伤小鼠肺组织中的动态变化。3.将K5-CrePR-YFP转基因小鼠作为供体鼠,通过Frop-2+ITGA6+ABSCs的异体移植实验,追踪供体鼠K5-YFP+ve干细胞在博来霉素肺损伤受体鼠肺组织中的动态变化。结果：成功构建了肺鳞癌转基因小鼠模型,并在小鼠体内观察到类似人肺鳞癌发生前的不同程度的上皮异型增生。所有肺鳞癌均发生在NICD1杂合突变型小鼠(NICD1纯合突变型小鼠均不能存活),提示NICD1可能作为肺鳞癌发生的驱动基因,在外在损伤刺激和P53及Lkbl共同缺陷的情况下,促使正常细胞转变为肺鳞癌细胞,从而参与肺鳞癌形成的过程。具体结果如下：(1)Ru486治疗组小鼠出现肺鳞癌,提示K5来源细胞可能具有肿瘤干细胞功能,在损伤刺激及基因缺陷共同作用下转变为肺鳞癌细胞。在所有小鼠中：①NICD1野生型小鼠,均状态如常。②NICD1纯合突变型小鼠,均于出生后早夭或在母体内流产。③NICD1杂合突变型小鼠,根据P53和Lkbl基因型的不同,表型明显不同：NICD1+/fl;P53fl/fl、NICD1+/fl; Lkb1fl/fl和NICD1+/fl; P53+/fl; Lkb1fl/fl小鼠如常。而NICD1+/fl; P53+/fl; LKB1+/fl、NICD1+/fl; P53fl/fl/; LKB1+/fl和NICD1+/fl; P53fl/fl; LKBfl/fl/三种基因型小鼠,肺自发鳞癌形成,三组的成瘤小鼠数目分别为1只、2只和2只,成瘤率分别为25.0%、28.6%和33.3%,潜伏期为5-12月。所有肺癌标本在免疫荧光染色后均强表达肺鳞癌标记物K5,而肺鳞癌标记物TTF1和cytokeratin 8(K8)表达缺失,经免疫学证实为肺鳞癌。(2) Adeno virus Cre (AdenoCre)治疗组小鼠出现肺鳞癌,且较Ru486治疗组小鼠病变更为严重,提示除K5来源细胞外,可能存在其它具有肿瘤干细胞功能的细胞群,在损伤刺激及基因缺陷共同作用下与K5来源细胞协同,共同转变为肺鳞癌细胞。与Ru486治疗组类似：①NICD1野生型小鼠,均状态如常。②NICD1纯合突变型小鼠,均于出生后早夭或在母体内流产。③NICD1杂合突变型小鼠,根据P53和Lkbl基因型的不同,表型明显不同：NICD1+/fl;P53fl/fl, NICDl+/fl; Lkb1fl/fl和NICDl+/fl; P53+/fl; Lkb1fl/fl小鼠如常。而NICD1+/fl; P53+/fl; LKB1+/fl, NICD1+/fl； P53fl/fl; LKB1+/fl和NICD1+/fl; P53fl/fl; LKB1fl/fl/三种基因型小鼠,肺部自发形成肺鳞癌,三组的成瘤小鼠均为1只,成瘤率均为100%,潜伏期为5-9月。所有肺癌标本在免疫荧光染色后均强表达肺鳞癌标记物K5,中等强度表达ProSPC,而肺鳞癌标记物TTF1和K8表达缺失,经免疫学证实为肺鳞癌。另外,我们还意外发现NICD1+/fl; P53fl/fl; LKB1fl/fl基因型小鼠在AdenoCre治疗后,而不是在Ru486治疗后,主气道上皮K5细胞活跃增生,黏液明显增多,正常纤毛丢失,Clara细胞消失。提示相同的损伤刺激和基因缺陷背景在近端大气道和远端肺组织可引起截然不同的病理改变：近端大气道的某些细胞(不包括K5来源细胞)可能过度分化为黏液分泌细胞,形成黏液增生性病变；而远端肺组织的某些细胞(包括K5来源细胞)可能转变为肿瘤细胞,参与肺鳞癌的形成。(3)Ru486治疗组与AdenoCre治疗组小鼠的主要区别有：①经AdenoCre治疗后的小鼠肺部肿瘤明显较Ru486治疗组小鼠肺部肿瘤多发,体积大,异型性更为明显。②经AdenoCre治疗后的小鼠明显较Ru486治疗组小鼠肺癌形成潜伏期短。③经AdenoCre治疗后的小鼠明显较Ru486治疗组小鼠成瘤率高。④相同基因背景的小鼠,经AdenoCre治疗后肺上皮增生和／或癌前病变的程度均较Ru486治疗组严重。⑤经AdenoCre治疗后Cre+; NICDl+/fl; P53fl/fl; LKB1fl/fl小鼠支气管黏液明显增多,纤毛减少,而经Ru486治疗组小鼠未见类似改变。另外,在第一部分实验中,我们发现K5来源细胞具有自我更新和增殖分化能力,具有干细胞潜能,具体结果如下：(1)流式分选培养及免疫荧光结果示：Trop-2+ITGA6+ABSCs富集K5来源干细胞。(2)自身示踪实验表明：K5来源细胞,而非K5+细胞在博来霉素肺损伤模型中增多,表现出向K8+祖细胞分化倾向,并可能参与损伤后肺新生血管及肺纤维化的形成。(3)异体移植实验表明：供体K5-YFP+ve细胞在博来霉素损伤受体鼠肺内明显增多,且表现出向K8+祖细胞分化倾向。结论：尽管目前已存在四种肺鳞癌转基因小鼠模型,但这些模型存在形成肿瘤类型混杂,成瘤时间长,成瘤率低,小鼠肺鳞癌与人肺鳞癌病理特征之间差别大等缺点,而我们成功构建的K5-CrePR; NICD1; P53; Lkbl肺鳞癌转基因小鼠模型在病理切片上呈现出气道上皮轻度异型增生至肺鳞癌的各阶段改变,更符合人肺鳞癌的发生发展过程。且具有形成肺癌类型单一,仅为肺鳞癌的优点。因此,可为临床人肺鳞癌的研究提供理想的工具鼠模型。另外,NICD1可能作为肺鳞癌发生的驱动基因在肺鳞癌的发生发展过程中起至关重要的作用,抑制Notch通路过度激活可能有助于预防肺鳞癌的发生。而K5来源细胞具有肿瘤干细胞的特征,抑制K5来源细胞的异常过度增生,可能为临床肺鳞癌的预防治疗提供新的思路。