TroponinⅠ及变体NGR-Troponin Ⅰ可容性表达和纯化的研究

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新生血管的形成是恶性肿瘤生长、浸润和转移的物质基础,阻止新生血管网的形成可以有效地治疗肿瘤。至1999年肌钙蛋白Ⅰ(TroponinⅠ)被报道具有强大的抑制血管新生的功能以来,TnⅠ作为一种极具研究和开发价值的新型抗肿瘤药物倍受关注。NGR短肽作为一种肿瘤血管内皮细胞特异性的靶向因子在近10年来得到了广泛的应用并且在动物实验上收到了良好的肿瘤治疗效果。由于TnⅠ性质不稳定极易变性,重组TnⅠ在大肠杆菌中表达时易形成无生物活性的包涵体产物。因此,要对它进行进一步地深入研究与应用,高效地表达、分离纯化具有生物活性的可溶性TnⅠ是必不可少的。为此,本文将TnⅠ,NGR-TnⅠ分别与Annexin V/pET28a(+),His-tag/pET28a(+),IMPACTTM这三种不同的载体进行融合,在大肠杆菌中表达,并就如何提高融合蛋白的可溶性表达进行了一系列探索,通过SDS-PAGE分析蛋白的表达和纯化的结果。通过Western blotting对纯化的蛋白进行验证,CAM试验对TroponinⅠ及NGR-TroponinⅠ的生物活性进行鉴定。实验结果表明,利用IMPACTTM系统与目的蛋白进行融合,并在低温及分子伴侣的辅助下能有效促进融合蛋白的可溶性表达,通过chitin亲和层析一步式裂解分离纯化能方便快捷地获得具有生物活性的TnⅠ。这为提高TnⅠ的可溶性表达提供了一个新的策略,并为以后TnⅠ作为抑制肿瘤血管生成的药物开发和深入研究奠定了基础。研究表明NGR-TnⅠ具有比TnⅠ更好的血管生成抑制活性。
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