论文部分内容阅读
目 的:1. 提出腹主动脉瘤(abdominal aortic aneurysm,AAA)发病的一个新机制,即乙酰肝素酶(heparanase)参与腹主动脉壁结构损伤与重构,促进腹主动脉局限性扩张及破裂。2. 建立一种新型可靠的大鼠AAA模型,突出其优越性,为深入AAA体内研究提供基础;同时进一步证实免疫炎症损伤与AAA形成和发展相关性。3. 在新型AAA模型基础上,探讨heparanase在异种移植血管反应中的作用以及与AAA发病关系。同时经过heparanase抑制剂治疗,进一步从反面和体内证实heparanase在AAA发病中的作用,并为AAA防治提供新思路。方 法:1. 选取人体肾下AAA、正常腹主动脉(NA)及原发性肝细胞癌组织标本,采用heparanase其底物硫酸乙酰肝素蛋白多糖(heparan sulfate proteoglycan,HSPG) cDNA探针与抗体,以及Von Willebrand Factor抗体,利用Northern杂交、原位杂交、免疫组化及计算机图像分析技术,定性、定位或半定量heparanase及HSPG蛋白与mRNA表达水平、微血管增生水平,以及它们在AAA发病中的病理意义。2. 根据异种组织移植排斥反应原理,选取种间差异较大的兔科和鼠科动物为研究对象,利用显微血管吻合技术,建立一种新型AAA大鼠模型。同时利用免疫组化、HE及血管特殊染色、电镜观察及计算机图象定量分析技术,对模型组织形态学特征作一较系统研究,并与目前最为常用的弹力蛋白酶灌注AAA大鼠模型进行了比较。3. 利用新型AAA模型,采用逆转录聚合酶链反应(reverse transcription-polymerase chain reaction, RT-PCR)、免疫组化及血管特殊染色等技术,在硫酸寡聚糖复合物(sulfated oligosaccharide phosphomannopentaose sulfate, PI-88)治疗前后,动态观察和比较异种移植血管反应中血小板聚集、heparanase表达、HSPG丢失、新血管形成以及它们之间的关系。同时观察 PI-88治疗后腹主动脉(瘤)形态学变化。<WP=5>结 果:一、heparanase及HSPG在人体AAA组织中的表达及临床病理意义1. 在AAA组织中,heparanase mRNA及蛋白水平表达明显高于NA;heparanase蛋白分别以增生的内外膜为主;heparanase mRNA表达与炎性细胞浸润程度和瘤体直径呈显著正相关,但与中膜平滑肌细胞减少无显著相关性。2. AAA壁HSPG阳性蛋白分布以内外膜为主,但表达水平明显低于NA;并且在heparanase蛋白表达水平较高的部位,HSPG明显减少。HSPG mRNA在AAA及NA组织中表达无显著差异。增生的微血管阳性染色以明显增厚的外膜为主,微血管密度(microvessel density, MVD)与heparanase mRNA水平呈显著正相关。二、新型AAA大鼠模型病理形态学特征1. 术后4周内异种移植组腹主动脉直径随时间逐渐增大,扩张率88.2%,腔内血栓形成率24.1%。HE染色显示,明显增生的内外膜存在大量免疫炎性细胞浸润和新生血管形成;中膜明显变薄,平滑肌细胞排列紊乱,密度明显降低。2. 移植AAA特殊染色可见,中膜弹力蛋白明显纤细、僵直,横切面上以前周相断裂最为严重。平滑肌层明显变薄,部分撕裂。计算机图像进一步分析显示,移植AAA内外径随时间逐步明显增加,血管壁各层虽有增减,但全层厚度明显增加,并且管腔面积仍有显著增大,弹力蛋白含量与外径呈显著负相关。3. 移植AAA超微结构显示,各层结构广泛破坏。内膜以幼稚型血管平滑肌细胞(smooth muscle cells, SMC)为主,部分为泡沫细胞,内皮细胞大部分坏死脱落,基底膜不完整,内膜下有脂质样沉积。中膜SMC大部分变性坏死或凋亡;弹力纤维纤细,断裂成碎片。外膜以淋巴细胞和单核巨噬细胞浸润为主。4. 免疫组化和TUNAL检测发现,移植AAA凋亡细胞明显高于对照组,其中阳性SMC凋亡占30%以上,与移植物外径间呈显著正相关。5. 与传统弹力蛋白酶灌注AAA大鼠模型比较发现,AAA形成率(62%)低于异种移植组(88%),并且瘤体直径、中膜SMC密度降低及炎性细胞浸润均以移植AAA程度更明显,但弹力蛋白破坏与减少又以灌注AAA更显著。三、移植AAA组织heparanase表达及PI-88的抑制作用1. RT-PCR结果显示,术后4周内移植AAA heparanase mRNA表达水平随时间有显著意义的递增,而术后1周内HSPG mRNA显著增加,接近最高水平,此后至实验结束处于一平台期。2. 免疫组化结果显示,移植AAA 明显增加的heparanase 蛋白以内外膜表达为主,伴有管腔密集的血小板沉积,MVD显著增加,但中膜、基底膜及内皮表面有明显HSPG丢失。<WP=6>3. PI-88治疗后移植物扩张率与移植物直径均有显著降低,移植物全层破坏、炎性细胞浸润和新血管增生程度均明显减轻。heparanase水平明显降低的同时,伴有基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase,MMP)2,9表达降低和弹力蛋白的增加,但减少的heparanase与MMP2,9间无显著相关性。结 论:1. 乙酰肝素酶通过HSPG降解和促进新血管形成,在基质和细胞水平参与腹主动脉结构损伤与重构,促进AAA形成与发展。2. 免疫炎症损伤介导的豚鼠—SD大鼠异种移植性AAA是一稳定可靠的新型动物模型,适于AAA发病机制和防治的体内研究。3. 免疫炎症可通过异种移植血管反应中血小板聚集激活与heparanase表达增强来介导移植腹主动脉损伤,诱?