HIV膜融合抑制剂是一种多肽类药物,它通过特异靶向HIV gp41NHR区域,抑制融合过程中核心六螺旋束的形成,从而阻断病毒入侵,在感染的初始阶段切断HIV病毒的传播。2003年,美国FDA批准了临床使用的唯一基于HIV表面融合蛋白gp41靶点的抑制剂恩夫韦肽,即T20。该多肽对逆转录酶抑制剂和蛋白酶抑制剂耐药及不耐药病人均具有很好的治疗效果,且副作用低,然而T20多肽存在着半衰期短,容易耐药等问题。理想的膜融合抑制剂应具有水溶性好,活性高,稳定,价格低廉等特点,因此亟需设计出一种具有高抗病毒活性,高广谱活性、高抗耐药性和较短片段的膜融合抑制多肽药物。Naito等设计的SC29EK是一个含有E-K模体(X-EE-XX-KK)的29个氨基酸多肽,其活性和抗耐药性较T20均明显提升,为了进一步探究SC29EK作用机制,我们将SC29EK进行逐个截短,结果发现SC29EK与SC28EK之间,仅相差一个氨基酸Asn但是抗病毒活性存在显著差异,这是否提示SC29EK的最后一个氨基酸Asn(位于病毒的gp41-145位点)对多肽与病毒结合有重要作用,据此我们开展了一系列实验。本次研究主要是针对gp41Asn-145位点的重要作用进行探究。首先通过抗病毒实验发现了 SC29EK与其截短的多肽抗病毒活性存在的显著差异。随后,选取代表性多肽T20与C34将其Asn-145位点替换为Ala,通过抗病毒和抑制细胞融合实验检测多肽活性差异;通过圆二色谱实验,评价了 HIV六螺旋束稳定性;通过ITC等温滴定量热实验,检测多肽与NHR反应时热量变化差异。同时,病毒自身CHR上同样含有Asn-145位点,将该位点突变后检测病毒的入侵和融合能力变化。MT钩子是位于多肽N端的特殊结构,而Asn-145位点位于C端,我们随后通过抗病毒实验探究了二者之间的关系。陆路教授等人报道的IDL是含有29个氨基酸的多肽,其C末端氨基酸IDL通过形成钩子样特殊结构与NHR特殊区域结合,我们对比了同为29个氨基酸的多肽间的活性差异。为进一步研究Asn-145位点的空间构象,我们运用晶体学方法,对含有SC29EK多肽的HIV六聚体进行结晶并成功解析了其结构。本次研究得到了以下结论:(1)Asn-145位点对于多肽抗病毒活性与抑制细胞融合活性十分重要,并且对于病毒的入侵与融合能力也起着重要作用。(2)研究发现位于C端的Asn-145位点与位于N端的MT-hook之间存在着调控关系。(3)SC29EK在多肽复合物的晶体结构中,我们发现Asn-145位点通过形成氢键与NHR互作,稳定六螺旋束。该构象十分保守稳定,能起到提高多肽活性的作用。此外,利用解析到的结构,我们进一步分析了 SC29EK多肽的作用机制以及SC29EK多肽的耐药病毒株耐药机制。本次研究通过多肽与病毒抗病毒活性的差异推断多肽与病毒结合的机制,为病毒进入机制的研究提供新思路。另外,以往的研究更关注多肽的N端氨基酸的作用机制,例如MT-hook,而本次研究则聚焦于多肽C端氨基酸的作用方式,并且进一步分析了两端氨基酸之间的作用关系,为多肽序列改造以及新多肽的设计提供思路。