Eta-1 mRNA在正常大鼠脊髓中及不同类型轴突损伤条件下的表达目的Eta-1（Osteopontin，OPN）是一种分泌性的粘性糖蛋白，最初由骨组织中分离出来，随后又在肾脏、内耳及其它一些组织中被发现。Eta-1的广泛分布显示其功能的多样性，但它的确切功能尚未完全知晓。近年来，发现在嗅球和脑干的神经元细胞中有Eta-1的表达，在局部脑缺血后激活的小胶质细胞中有也有Eta-1的表达，表明在中枢神经系统中，Eta-1也起着一定的作用。但是在中枢神经系统的另一种成分——脊髓中的分布情况，目前仍不清楚。脊神经轴突损伤是骨科医生在临床实践中经常面临的难题。其损伤后的病理变化机制和影响轴突再生的分子机制，尚不完全清楚。脊神经轴突损伤后脊髓运动神经元的命运与损伤的部位密切相关。在成年大鼠，大腿中段坐骨神经切断后，几乎不引起脊髓运动神经元的死亡；而脊神经根撕脱伤引起的近端轴突损伤，因其发生在CNS（脊髓）与PNS交界处，会导致CNS大量的脊髓运动神经元死亡（80％）。CNS和PNS对轴突损伤的反应有本质的区别。在PNS中，切断的轴突可长距离再生，至少使部分神经功能得以恢复；而在CNS中，损伤的轴突纤维束不能成功再生而重新支配远端纤维束。研究表明，组织特异性环境可以启动损伤相关的巨噬细胞的不同分子程序（programming），从而影响损伤轴突再生的程度。细胞外基质糖蛋白Eta-1是损伤相关的巨噬细胞的最丰富的分泌产物之一。已经发现，在脑、心脏、和其他外周器官系统的损伤模型中，有Eta-1的表达。功能上，Eta-1可以为巨噬细胞、纤维母细胞和星形细胞提供趋化刺激，并可介导炎症反应和自身免疫过程中的免疫调节效应。但在不同类型的轴突损伤中Eta-1的表达变化怎样?尚无相关报道。因此，在本研究中，先用原位杂交和荧光免疫组化的方法，观察Eta-1 mRNA在成年大鼠脊髓中不同节段的表达。然后建立大鼠脊神经根撕脱伤和坐骨神经切断伤的模型，研究Eta-1在不同轴突损伤条件下表达的变化，探讨其在神经系统中轴突损伤和再生的分子机制中可能的作用。材料与方法1、正常组织标本采集8周龄Wistar雄性大鼠10只，平均体重200g，戊巴比妥钠麻醉后，用冷生理盐水及4％的低温多聚甲醛行心内灌注。收集含有C5-7，T8-10，L2-4脊髓节段的组织块，于固定液中4℃过夜固定，然后低温保护于含20％蔗糖的PBS溶液中过夜。用恒温切片机切取12μm的切片并放置于多聚赖氨酸包埋的载玻片上。2、用原位杂交法确定Eta-1在正常脊髓中有无表达3、原位杂交与荧光免疫组化双染色原位杂交反应后，PBS清洗切片5min，然后与一抗在4℃下反应过夜。一抗为单克隆小鼠抗NeuN抗体。切片用PBS冲洗三次以上，每次10min。最后与Alexa荧光488共轭的羊抗小鼠IaG抗体反应并用荧光固定剂固定于载玻片上。4、建立脊神经根撕脱伤的动物模型所有实验用鼠均为八周龄雄性Wistar鼠（均重200g，40只）。用改良Koliatsos法制作腰3、4节段神经的椎管外撕脱模型。5、建立坐骨神经切断伤的动物模型八周龄雄性Wistar大鼠40只，均重200g。于左大腿中段暴露左侧坐骨神经后，切断坐骨神经，近端用丝线结扎，使断端保持分离。6、轴突损伤大鼠的组织标本采集分别于致伤后1，3，7，14和21天处死实验用鼠。采集L₂-L₅节段脊髓，并迅速冻存于液氮中，以备Northern印记杂交分析用。为行组织学评估，用冷生理盐水及4％的低温多聚甲醛行心内灌注。收集含有L₃、L₄脊髓的组织块，以及左侧坐骨神经（包含损伤处在内约6mm），于固定液中4℃过夜固定，然后低温保护于含20％蔗糖的PBS溶液中过夜。用恒温切片机切取12μm的切片并放置于多聚赖氨酸包埋的载玻片上。7、制备DIG（digoxigenin异羟基洋地黄毒甙元）标记的Eta-1探针8、Northern印记杂交9、Nissl染色：利用甲酚紫对切片进行染色。10、原位杂交11、免疫组化按文献进行免疫组化反应。一抗是小鼠抗神经细胞核抗体及抗人类Eta-1单克隆抗体和小鼠抗大鼠CD11b单克隆抗体（OX42）。为了在一张切片中认证两种组织抗原，我们应用改良的Vandesande双染色方法。12、原位杂交与荧光免疫组化双染色13、细胞计数（NeuN阳性神经细胞、OX42活性巨噬细胞及表达Eta-1的细胞）随机从切片中同侧及对侧的脊髓前角选取0.147mm²大小的范围，计数NeuN、OX42和Eta-1阳性的细胞。同法，随机从后角选取两块0.147mm²大小的范围，计数OX42活性小神经胶质细胞。14、统计学分析采用方差分析评估组间差异，并用Fisher最小显著差数检测方法进行检测。P值小于0.05有显著意义。结果1、Eta-1mRNA在脊髓运动神经元中表达原位杂交结果显示Eta-1 mRNA在前角运动神经元中表达，而在后角中无表达。Eta-1在运动神经元细胞中的表达通过NeuN的荧光免疫组化和Eta-1的原位杂交双染色法进一步得到证实。2、Northern印记杂交正常脊髓中Eta-1 mRNA表达水平较低。而从撕脱伤后的第1天起，其表达水平开始上调，并于伤后1-3天达高峰。其峰值比正常组高1.8倍（P＜0.05）。3、脊神经根撕脱伤导致运动神经元损伤从伤后第3天起，损伤侧前角运动神经元数目开始明显减少，运动神经元的减少随时间显著增加，在伤后第21天，伤侧已有50％以上的运动神经元降解，伤侧运动神经元的数量为对侧的45％。4、撕脱伤组和对照组中Eta-1阳性的运动神经元细胞及星形胶质细胞情况损伤后第3天，在伤侧运动神经元细胞中的杂交信号表达水平升高。第21天时，Eta-1 mRNA的表达恢复到正常水平。对照组后角未见Eta-1 mRNA的表达，而在损伤后第3天的伤侧后角小细胞中可见Eta1- mRNA的表达，该表达在第21天消失。结合荧光免疫组化及Eta-1的原位杂交，证实表达Eta-1的细胞为运动神经元细胞和星形胶质细胞。5、神经根撕脱伤后Eta-1在巨噬细胞中的表达在未损伤组织中，存在些许分枝的OX-42活性细胞。损伤后的第1天起，出现了许多OX-42标记强阳性的巨噬细胞；这些细胞小而圆，呈变形虫样，且在第3天最为丰富。该类细胞的一部分与Eta-1免疫组化反应活性较强的细胞重叠，而Eta-1免疫组化反应阳性的细胞在伤后第1天开始增加，在第3天达峰值。6、坐骨神经切断后Eta-1在巨噬性细胞中无表达坐骨神经切断伤后，在神经切断处附近，有大量的巨噬细胞浸润，但与神经根撕脱伤组不同的是，在伤后3天及以后的各个检测时间点，均未检测到Eta-1的表达。脊髓前角运动神经元数量无明显变化，运动神经元表达的Eta-1亦无明显改变。7、撕脱伤后Eta-1阳性的神经元细胞及巨噬细胞的定量分析我们比较撕脱伤后第3天，在损伤侧及对侧的前角运动神经元（NeuN阳性）及后角巨噬细胞（OX-42活性）中，表达Eta-1的细胞数量。虽然伤侧NeuN阳性的神经元细胞数量减少，但表达Eta-1的细胞数量增加了。与对侧比较，在后角中OX-42阳性的巨噬细胞及表达Eta-1的细胞同时增加。结论Eta-1 mRNA在整个脊髓节段，在特定的运动相关区域（脊髓前角）的分布，在本实验中首次被证实，提示Eta-1在正常生理状态下，在成熟脊髓中可能有其特殊的作用。但Eta-1在脊髓中的确切作用仍需进一步研究。在脊神经根撕脱伤后的运动神经元、星形胶质细胞及活化的巨噬细胞中可观察到Eta-1表达的上调。而在坐骨神经切断伤后，无Eta-1的表达。我们认为Eta-1在神经系统中有多种不同的功能：①是在炎性反应过程中，由神经胶质介导（或由神经元介导）的促进炎症反应作用；②在成熟CNS的“抑制轴突损伤后再生”的“非允许”环境中，由巨噬细胞表达的Eta-1可能发挥了迄今我们尚不知晓的轴突抑制作用；③是保护神经元细胞抵御iNOS介导的降解。