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狂犬病是由狂犬病病毒属(Lyssavirus, Lv)引起的所有温血动物都易感的烈性传染病。目前该属有14种病毒,包括国际病毒分类委员会(International Committee on Taxonomy of Viruses, ICTV)公布的12种Lv,分别为7种主要Lv和5种新定Lv,以及最新发现的2种待定的Lv。除第2种,及5种新定Lv和2种新发现的病毒未见报道外,其他Lv成员都能引起人的狂犬病。本实验所涉及Lv的7种主要病毒分别为：第1种Lv,经典狂犬病病毒(Classic rabies virus, RABV);第2种Lv,拉各斯蝙蝠病毒(Lagos bat virus, LBV);第3种Lv,蒙哥拉病毒(Mokola virus, MOKV);第4种Lv,杜文哈根病毒(Duvenhage virus, DUVV);第5种Lv,欧洲蝙蝠狂犬病病毒1型(European bat lyssavirus1, EBLV-1);第6种Lv,欧洲蝙蝠狂犬病病毒2型(European bat lyssavirus2, EBLV-2);第7种Lv,澳大利亚蝙蝠病毒(Australian bat lyssavirus, ABLV)。目前99.8%的人和动物的狂犬病是由这7种主要Lv引起。OIE推荐的狂犬病确诊金标方法一动物脑组织直接免疫荧光(FAT)不能对Lv鉴别。目前对Lv鉴别检测的分子检测技术,如RT-PCR、RT-qPCR、PCR结合测序等方法,存在着检测通量低、灵敏度不高、特异性不强和费时费力的缺点。因此,建立一种对7种主要Lv快速检测和鉴别的方法尤为必要。基因芯片技术为病毒性传染病诊断提供了高效、特异和自动化的方法,其原理为将已知核酸序列按照一定矩阵点制到固相载体上,这些探针再和具有荧光标记的核酸靶标杂交,杂交结果通过具有相应荧光激发波长的扫描仪获取。本研究目的：建立一种对7种主要Lv快速、灵敏检测和鉴别的基因芯片方法,并用狂犬病疑似临床样品对建立的方法评估。方法：根据目前7种主要Lv的N基因编码区62-442nt片段设计Lv特异寡核苷酸探针,每个种设计多条探针使之在最大程度上覆盖该种所有变异株。寡核苷酸探针长度为60-70nt,允许一定数量的碱基错配,可用于检测同源性高的新变异株。使用可扩增Lv所有种的巢式RT-PCR (RT-nPCR),扩增标记N基因的62-442nt片段,以提高芯片的检测灵敏度。比较评估基因芯片方法和目前常规狂犬病诊断方法在狂犬病临床样品检测中的灵敏性和特异性。本课题的主要结果：1、探针设计及筛选本研究选取206条Lv各种具有代表性毒株N基因序列作为芯片探针设计的参考序列,与Lv同源性极低的E.coli pGM-T质粒和拟南芥的一段基因组作为对照探针设计参考序列,共设计了长度为60-70nt,Tm值为75±5℃的寡核苷酸探针78条,对照探针7条。通过BLAST及标准参考毒株筛选验证,最终确定50条种特异探针和7条对照探针用以构建Lv芯片,命名为：" LyssaChip "。2、LyssaChip设计在对LyssaChip探针点样矩阵设计时,为方便芯片杂交结果观察,我们设计了“表盘式”探针点样模式。该模式为：中心与四角4个探针点为绿色荧光标记探针,用于定位“表盘”位置,共8个点；点样图12点钟方向为阳性对照探针6个点、阴性对照探针6个点；1点到2点钟方向为Lv第1种(RABV)探针点阵,共12个；3点钟方向为Lv第2种(LBV)探针点阵,共14个；4点到5点钟方向为Lv第3种(MOKV)的探针点阵,共17个；6点钟方向为Lv第4种(DUVV)探针点阵,共12个；7点到8点钟方向为Lv第5种(EBLV-1)探针点阵,共12个；9点钟方向为Lv第6种(EBLV-2)探针点阵,共22个；10点到11点钟方向为Lv第7种(ABLV)探针点阵,共14个。每个探针点均为2个重复,每种均有6到11条探针,以期在最大程度上检测各种Lv的所有亚型。为提高LyssaChip检测通量,我们在一张芯片点制12个“表盘式”探针点阵,同时用于12份样品检测,可以完成中通量的检测任务。3、LyssaChip构建及优化所有寡核苷酸探针经氨基化修饰,用芯片点样仪印迹于醛基化修饰的玻璃基片上,制备芯片。通过优化标记样品制备、杂交液配置和杂交条件,确定了LyssaChip标准使用流程：常规方法提取样品RNA,用HEX修饰过的引物扩增标记靶核酸；用12μL杂交缓冲液(99%甲酰胺、1×SSC、2%SDS、50×Denhardt’s、标记阳性对照各2μL,补水至12μL)混合8μl荧光标记样品,43℃杂交3.5h；用芯片扫描仪读取杂交结果,阳性点定义：SNR=2,且F532Median-B532=800,反之为阴性点。4、LyssaChip验证及评估用Lv的1-7种参考灭活病毒验证,LyssaChip方法可准确而特异地鉴别区分这7种参考毒株。LyssaChip可检测最低cDNA模板浓度：RABV,LBV,MOKV, DUVV, EBVV-1,和ABLV为2.46×105molecules/μl; EBLV-2为2.46×104molecules/μl;可检测最低狂犬病标准SRV9疫苗细胞毒滴度为0.158个TCID50/ml,其灵敏度是本实验已建立RT-nPCR和RT-qPCR方法的10倍。对RABV, DUVV, EBLV-2, ABLV灭活病毒模拟临床多重感染试验表明,LyssaChip具有同时检测样品中不同种病毒交叉感染的能力。对LyssaChip保存期(第30、60、90、150和210天)和保存环境(-20℃、4℃和常温20±2℃)试验评估,确定LyssaChip最佳保存条件和时间为-20℃避光保存,有效期至少为150天。5、LyssaChip应用本研究用LyssaChip检测临床样品共111份,其中65份为2004-2010年间本实验室保存的狂犬病临床疑似动物脑组织样品(犬、牛、羊、貉),46份犬脑组织样品为2010年湖南动物疾控中心送检的采集于宁远县和衡阳市部分狗肉馆的样本。这111份临床疑似样品分别使用金标方法FAT、常规RT-nPCR和LyssaChip鉴定。相对于金标方法FAT, LyssaChip表现出很高的灵敏性(CI：94.48%100%)和特异性(CI：82.10%-98.63%)。经过Kappa一致性检验,LyssaChip与金标方法FAT具有非常高的一致性(κ=0.944)；McNemar χ2差异性检验结果表明,这两种方法之间不一致部分(3份FAT阴性,LyssaChip阳性)的差别具有统计学意义(P<0.0001),说明LyssaChip阳性检出率更高。另外,LyssaChip结果与本实验室建立的RT-nPCR方法同样表现出非常高的一致性(K=0.981)。在2010年欧盟举行的国际狂犬病实验室间比对试验中,我们使用LyssaChip方法准确检测出送检的7份盲样中阳性和阴性样品,并成功鉴别出阳性样品中4种Lv,分别为RABV, EBLV-1, EBLV-2, ABLV。该方法与同时应用于盲样检测的FAT、RT-nPCR和RT-qPCR方法的共同阳性检出样品完全符合；所不同的是相对于RT-qPCR, LyssaChip多检出4种Lv感染的样品；相对于FAT和RT-nPCR, LyssaChip区分出了样品中病毒的种类。本课题研制的LyssaChip可应用于快速、高通量检测和区分临床样品中7种Lv主要病毒。一张LyssaChip可同时检测12份样品,所需操作时间不到8小时,其中包括：1小时RNA提取,3小时RT-nPCR,3.5小时芯片杂交和30分钟芯片洗涤和扫描。而同样工作,传统基于RT-nPCR产物测序方法是不可能在同样时间内完成。同时,单次试验可允许同时操作7-8张芯片,即可检测84-96份样品,而最终用于每份样品的检测费用大约为35元人民币,与传统的测序方法相当。结论：本研究成功研制出一种可应用于Lv的7种主要病毒快速、准确、特异检测与鉴别的基因芯片(LyssaChip)方法,经过临床应用评估,该方法可作为临床诊断实验室备选的分子检测技术,应用于Lv的7种主要病毒的快速检测和鉴别。