纤维素在地球上分布广泛,随处可见,我国地大物博,资源丰富,纤维素资源也是极其丰富,但是,由于其结构稳定、不易水解等特点,大大限制了其利用范围。如果可以利用大量微生物,让它们产生降解纤维素的酶,通过酶将纤维素分解转化,不仅可以解决环境污染的问题,而且可以合理利用纤维素资源。此外,纤维素资源的合理利用,对开发饲料资源,生产农业能源,发展畜牧业资源,减轻人类对环境的污染都具有重大的意义。虽然人们在纤维素酶的筛选方面,做了大量研究工作,并且也获得了一定的成果,但是截止到现在,产酶能力高的菌株由于其自身的诸多局限,没有被很好的利用。随着生物技术的发展,有关β-内切葡聚糖酶基因的克隆和表达的研究越来越深入,但是,由于各种条件如耐热性差,稳定性差等的限制,真正转化为生产实践的基因工程菌少之又少。因此,利用合理的方法构建高表达β-内切葡聚糖酶基因工程菌并应用于生产实践,将大大加快纤维质原料在工农业生产的利用步伐。1.本实验采用刚果红染色法(Congo red staining),选择灌木丛、腐木、稻杆堆积等纤维素含量丰富的土壤中取样,通过羧甲基纤维素钠固体培养基富集后分离单菌落,以刚果红染色法(Congo red staining)进行复筛,筛出6株水解圈大,CMC酶活力高的菌株,编号后,对它们进行16Sr DNA及生理生化的鉴定,结果发现,2号为蜡状芽孢杆菌(Waxy bacillus),5号为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis),9号为巨大芽孢杆菌(Huge bacillus),10号为地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis),11号为微小杆菌(Tiny bacteria),12号为绿色木霉(Green trichoderma viride)。利用候选菌株对两种不同的纤维质材料麸皮和米糠进行固态发酵,DNS法测量了OD值,计算出发酵后的酶活力,结果显示,地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)发酵后的酶活力最强,麸皮和米糠作为底物发酵后酶活值分别达到3437U/ml和8541U/ml,为工农业生产及畜牧业带来了巨大的的应用前景和经济效益。2.在上述候选菌株中,本研究选择酶活力最大的10号菌株地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)作为研究对象,对其生长条件包括发酵温度、时间及含水量进行优化,结果发现:当培养温度为30°C,培养时间达到60 h,初始水分含量为40%时,其产酶能力达到最大。为进一步利用此菌株进行工业化生产和饲料研究奠定了理论基础,也为以后的应用指明了方向。3.依据已公布的纤维素内切葡聚糖酶基因(www.ncbi.nlm.nih.gov),设计特异性引物,进行PCR扩增获得一长度为732bp的特异产物,测序后发现该基因序列与公布的纤维素酶基因片段同源性达99%,表明成功克隆到该基因。4.在上述获得的纤维素酶基因两端引入ECOR1和HandⅢ酶切位点,重新设计引物获得PCR产物后,将该纤维素酶基因连接到PET-28a载体上,并转化到大肠杆菌,获得基因工程菌。酶切后进行聚丙烯酰胺凝胶电泳,成功获得大小为27.1KD的表达产物。从而证明,该基因工程菌成功构建并表达出预期产物。通过与10菌株酶活力的进行比较后发现,该重组菌的酶活力有明显的提高。