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对生物过程中的机制研究依赖于遗传学操作,通过分析对相关基因活性进行干扰导致的表型可推断出其扮演的角色。实现基因组的敲入有利于我们更加精确的检测或操纵目标基因的表达,加深我们对相应生物过程的了解。果蝇作为模式生物以多样化的遗传学操作见长,但于感兴趣的基因组位点处实现不引入多余外源片段的精确敲入一直是个短板。规律成簇间隔短回文重复序列(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats,CRISPR)和CRISPR 相关蛋白 9(CRISPR-associated protein 9,Cas9)系统,该系统通过RNA引导,可以特异地结合并切割外源遗传物质,实现细菌和古细菌的获得性免疫。利用CRISPR/Cas9这一特性,尤其是人为改造过Type Ⅱ CRISPR/Cas9系统后,该系统已经被广泛应用于基因编辑。本课题利用该技术分别在基因的3’ UTR、内含子、外显子区域内实现精确基因敲入,并成功引入筛选用的可视性标记表型。本课题成功实现了在PINK1的3’ UTR中敲入荧光蛋白mCherry,得到PINK1-mCherry等位基因的果蝇,而且该等位基因能够行使正常PINK1的功能。检测mCherry红色荧光的分布情况就可以了解内源PINK1在细胞中的分布情况。同时,我们也在Dpp的外显子区域中敲入了荧光蛋白Dendra,外源Dendra的插入也没有影响Dpp的功能。然而,这些基因的敲入需要通过PCR技术进行筛选,需要耗费大量的劳力物力。因此,本课题引入了可视性标记基因,即在Hh的内含子中敲入带有SA和SD连接序列Dendra,还有3p3-DsRed基因。带有3p3-DsRed基因果蝇的眼睛在激发光的照射下可以看到红色的荧光,方便阳性果蝇的筛选。敲入成功以后,Hh能够被Dendra标记,同时不影响Hh行使正常功能。Hh和Dpp都是形成素,敲入Dendra后,对于研究内源Hh和Dpp的扩散和浓度梯度的形成具有重大意义。另外,本课题还在Hh的内含子中敲入attB和影响果蝇体色的可视性标记基因—yellow基因。敲入attB位点后,为以后插入其他荧光蛋白提供便利。本课题通过注射表达Cas9蛋白的果蝇胚胎,子代的阳性效率比较高。与此同时,我们也发现Cas9系统存在的脱靶现象。