【摘 要】
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细胞穿膜肽（cell-penetrating peptides,CPPs）是一类具有穿膜功能的小分子短肽,可高效携带核酸、肽、蛋白质等生物大分子穿过细胞膜进入细胞质发挥功能,在介导生物大分子药物入胞上有着高效、低毒等诸多优势,已广泛应用于各个领域,如作为运输成像剂的载体,作为抗菌消炎药物,作为抗肿瘤药物的传递载体以及作为疫苗的传递载体等。瑟氏泰勒虫（Theileria sergenti）是一种寄生
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细胞穿膜肽（cell-penetrating peptides,CPPs）是一类具有穿膜功能的小分子短肽,可高效携带核酸、肽、蛋白质等生物大分子穿过细胞膜进入细胞质发挥功能,在介导生物大分子药物入胞上有着高效、低毒等诸多优势,已广泛应用于各个领域,如作为运输成像剂的载体,作为抗菌消炎药物,作为抗肿瘤药物的传递载体以及作为疫苗的传递载体等。瑟氏泰勒虫（Theileria sergenti）是一种寄生在牛红细胞内的血液原虫,主要通过长角血蜱进行传播,能引起牛的慢性贫血,对养牛业造成了一定的危害。尤其是外地引进牛、纯种牛和改良杂种牛的危害特别严重,影响养牛业的健康发展。虽然DNA疫苗与传统的疫苗相比具有安全、易制备等优势,但其免疫效果还有待进一步提高,且到目前为止,还没有CPPs在增强寄生虫DNA疫苗免疫效果方面的研究。因此,继本课题组一直从事牛瑟氏泰勒虫病的研究,本试验以牛瑟氏泰勒虫DNA疫苗为研究对象,探讨了一种CPPs对DNA疫苗免疫应答的影响,旨在为今后DNA疫苗研究提供一种新的策略。本试验根据Genbank上已发表的瑟氏泰勒虫P33基因序列（DQ078264）,设计一对特异性引物,以所提取的感染了瑟氏泰勒虫的牛的抗凝血DNA为模板,PCR扩增得到P33基因的目的片段,将目的片段克隆到真核表达质粒pVAX1上,构建pVAX1-P33重组质粒。将鉴定正确的pVAX1-P33重组质粒与CPPs以一定的电荷比混合,并命名为CPPs-pVAX1-P33,将其转染到vero细胞,通过间接免疫荧光鉴定其表达。将40只雌性昆明小鼠随机平均分成4个组,分别接种CPPs-pVAX1-P33、pVAX1-P33、pVAX1和PBS,每2周接种一次,总共接种3次。在3免后2周利用流式细胞技术检测每组小鼠的CD3+、CD4+和CD8+的含量。同时,在每次免疫前以及第3次免疫后每2周,采取小鼠血液并分离血清,利用ELISA法检测并记录每组小鼠的牛瑟氏泰勒虫特异性抗体、Ig G1、Ig G2a、IFN-γ、IL-2、IL-4以及IL-6的水平,以此来综合评价小鼠的细胞和免疫应答效果。试验结果显示,所构建的真核表达质粒pVAX1-P33与Genbank上发表的瑟氏泰勒虫P33基因序列同源性为99.49%。转染结果表明,CPPs-pVAX1-P33能在未加脂质体转染试剂的情况下成功转染到vero细胞中并表达。流式细胞技术结果显示,CPPs-pVAX1-P33组和pVAX1-P33组的CD3+和CD4+的含量极显著高于pVAX1组和PBS组（P＜0.01）,且CPPs-pVAX1-P33组和pVAX1-P33组间存在极显著差异（P＜0.01）,CPPs-pVAX1-P33组和pVAX1-P33组的CD8+含量显著高于pVAX1组和PBS组（P＜0.05）,且CPPs-pVAX1-P33组和pVAX1-P33组间存在极显著差异（P＜0.05）,此外,CD4+/CD8+各组间均无显著差异（P＞0.05）;ELISA结果显示,CPPs-pVAX1-P33组和pVAX1-P33组小鼠前6周,小鼠血清中的牛瑟氏泰勒虫特异性抗体、Ig G1、Ig G2a、IFN-γ、IL-2、IL-4以及IL-6的水平呈上升趋势,第6周后开始逐渐下降,在第6周达到最高,CPPs-pVAX1-P33组和pVAX1-P33组与pVAX1组和PBS组相比,差异极显著（P＜0.01）,且CPPs-pVAX1-P33组和pVAX1-P33组之间存在极显著差异（P＜0.01）。综上所述,本试验所制备的CPPs成功将牛瑟氏泰勒虫DNA疫苗转染到vero细胞,且显著增强了牛瑟氏泰勒虫DNA疫苗对小鼠诱导的体液免疫应答和细胞免疫应答效果。本研究结果为今后的分子生物学基因转染和DNA疫苗的研究提供了一种新的策略。
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