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脓毒症是临床常见的危重病症,如不及时治疗和控制,可导致脓毒性休克、多器官功能不全,甚至死亡,是当前重症监护室(Intensive Care Unit,ICU)死亡的主要原因。脓毒症的发生率和死亡率较高,心脏功能障碍是脓毒症致重要器官功能障碍,乃至患者死亡的重要原因之一。当脓毒症伴有心脏功能障碍时,其死亡率高达70%以上。目前针对脓毒症后心脏功能障碍尚无特异的治疗措施。垂体中叶素(Intermedin,IMD)是降钙素基因相关肽家族成员,以往的研究证实IMD在体内可降解为具有活性的IMD1-53片段,研究证实IMD1-53对缺血再灌注心肌具有明显的保护作用,IMD1-53对缺血再灌注心肌的保护作用主要与其抗氧化、抑制细胞凋亡有关,但IMD1-53对脓毒性休克心脏收缩功能是否具有保护作用,其机制如何,目前无相关研究。据此,本研究利用大鼠盲肠结扎穿孔(cecal ligation and puncture,CLP)复制脓毒性休克模型,以心肌为研究对象,研究IMD1-53对脓毒性休克大鼠心脏收缩功能的保护作用并初步探讨其机制。具体内容包含三部分:(1)IMD1-53对脓毒性休克大鼠心脏收缩功能的作用;(2)IMD1-53调节脓毒性休克心脏收缩功能的机制;(3)IMD1-53对脓毒性休克大鼠的整体保护效果。主要实验内容和方法:用盲肠结扎穿孔术复制脓毒性休克模型,取心肌乳头肌,用离体张力系统测定对异丙肾上腺素的反应性;急性分离心肌细胞,采用细胞微张力系统测定心肌细胞的收缩力;用蛋白免疫印迹(western blot,WB)测定心肌Rho kinase和肌钙蛋白亚单位(Troponin I,Tn I)、Tn I磷酸化以及大电导钙激活钾通道(large conductance Ca2+-activated K+channel,BKCa)的表达;用膜片钳方法测定BKCa通道的电流。实验分成三部分:第一部分主要从整体动物、离体心肌乳头肌和心肌细胞水平观察IMD1-53对脓毒性休克心脏收缩功能的影响;第二部分主要探讨IMD1-53对脓毒性休克大鼠心脏收缩功能的保护机制,分别从整体、离体和细胞水平研究钙敏感性和钙离子通路在IMD1-53保护脓毒性休克心脏收缩功能的作用及相关分子机制;第三部分主要在整体动物水平观察IMD1-53是否通过保护心脏收缩功能来实现对脓毒性休克的保护作用。主要研究结果:第一部分IMD1-53对脓毒性休克心脏收缩功能的保护作用1、脓毒性休克后心脏功能明显受损,表现为大鼠的心输出量(cardiac output,CO)、心脏指数(cardiac index,CI)和每搏指数(stroke index,SI)明显降低,整体给予IMD1-53(0.5μg/kg)后,可明显改善脓毒性休克大鼠的心脏功能,CO、CI和SI显著增加。2、脓毒性休克后,心肌乳头肌对异丙肾上腺素的反应性明显降低,表现为乳头肌对电刺激(0.2Hz,10ms)收缩幅度明显降低,给予IMD1-53治疗后,可明显提高心肌乳头肌对异丙肾上腺素的反应性。3、急性分离心肌细胞,采用细胞微张力系统测定心肌细胞收缩力,发现:脓毒性休克后心肌细胞对电刺激(0.5Hz,5ms)收缩力明显降低,输注IMD1-53后,心肌细胞收缩力明显升高。上述结果说明:IMD1-53对脓毒性休克心脏收缩功能具有明显的保护作用。第二部分IMD1-53对脓毒性休克大鼠心脏收缩功能的保护机制1、IMD1-53保护脓毒性休克心脏收缩功能与Rho kinase/Tn I磷酸化通路的关系(1)脓毒性休克后,心肌组织的Rho kinase表达明显下降,Tn I磷酸化水平明显升高,IMD1-53处理可明显增加Rho kinase的表达和降低Tn I磷酸化水平。(2)脓毒性休克后,大鼠的心肌乳头肌的收缩反应性和最大收缩张力(maximal contraction tension,Emax)均明显降低;IMD1-53治疗后,心肌乳头肌收缩反应性明显升高;Rho kinase的抑制剂Y27632(10-5mol/L)可明显拮抗IMD1-53对脓毒性休克心肌乳头肌反应性的增加。(3)脓毒性休克后Rho kinase的表达明显下降,IMD1-53治疗后可增加其表达,Rho kinase抑制剂Y27632(10-5mol/L)可拮抗由IMD1-53引起的Rho kinase表达的增高,同时Rho kinase抑制剂Y27632(10-5mol/L)可以拮抗由IMD1-53引起的Tn I磷酸化水平的降低。结果说明:Rho kinase/Tn I磷酸化通路在IMD1-53保护脓毒性休克心脏收缩功能中有重要作用。2、IMD1-53保护脓毒性休克心脏收缩功能与BKCa的关系在整体实验中,脓毒性休克以及IMD1-53治疗后,BKCa的表达无显著变化,但在离体实验用LPS(lipopolysaccharide,100μg/ml)刺激心肌细胞模拟脓毒性休克后,心肌细胞BKCa通道明显开放,BKCa的电流增加,IMD1-53可降低由LPS刺激引起的BKCa开放;BKCa的开放剂(NS1619,300μmol/L)可拮抗由IMD1-53引起的脓毒性休克心肌收缩反应性的增加。第三部分IMD1-53对脓毒性休克大鼠的整体效果1、IMD1-53对脓毒性休克大鼠组织氧供、氧耗、器官血流量和血气的影响脓毒性休克后,大鼠组织氧供、氧耗以及肝、肾、肠的血流量显著降低,IMD1-53(0.5μg/kg)治疗可明显改善组织氧供、氧耗和肝、肾、肠的血流量;与脓毒性休克比较,大鼠的Pa O2和Sa O2在IMD1-53复苏后有所升高。2、IMD1-53对脓毒性休克大鼠存活时间和存活率的影响脓毒性休克后,大鼠的存活时间和存活率均显著降低,72h平均存活时间为5.1h,无动物存活超过72h,IMD1-53(0.5μg/kg)可明显延长大鼠的存活时间,提高存活率,IMD1-53早期和晚期治疗后72h平均存活时间分别为25.8h和19.6h,存活率分别为5/16和4/16。结果说明IMD1-53通过保护脓毒性休克心脏收缩功能发挥对脓毒性休克大鼠的保护作用。结论:1、IMD1-53对脓毒性休克大鼠心脏收缩功能有明显的保护作用,并通过心脏收缩功能的保护作用实现对脓毒症的保护。2、IMD1-53对脓毒性休克心脏收缩功能的调节作用主要与Rho kinase/Tn I磷酸化和BKCa通道有关,主要通过增加Rho kinase和Tn I磷酸化,抑制BKCa通道开放实现。