背景与目的Wnt信号是所有多细胞生物胚胎发育中一个基础环节,在调节成体组织更新和器官动态平衡中发挥着积极作用。异常的Wnt信号是许多类型肿瘤(包括直肠癌,乳腺癌,前列腺癌,胰腺癌及白血病等)、关节炎和肾脏等疾病的来源。研究最多的最清楚的,则是经典通路,即Wnt/β-catenin通路,目前多种研究已证明,经典通路在胚胎及肿瘤发展中有重要作用,多种肿瘤中β-catenin表达水平明显增高,小鼠敲除β-catenin基因后肿瘤转化的能力降低,通过RNA干扰技术发现针对β-catenin的SiRNA可以抑制肿瘤生长,表明针对Wnt/β-catenin的靶向治疗可能成为肿瘤治疗的一个新的途径。MDS (Myelodysplastic Syndromes骨髓增生异常综合征)是一组异质性克隆性造血干细胞疾病,其生物学特性是髓系(粒系、红系、巨核系)一系或多系发育异常和无效造血,可伴有原始细胞增多。MDS高危患者常常有转化为白血病的现象。而现在的研究热门Wnt/β-catenin通路,在白血病中的研究较为常见,在MDS中的研究尚少,国外非常少见,国内对于MDS中WNT/β-catenin信号传导通路的研究则集中在其拮抗剂SFRPs家族上,直接针对WNT/β-catenin信号传导通路的研究还未有报道。本实验应用RT-PCR法及Western blotting法检测MDS患者骨髓细胞中β-catenin的表达水平,分析β-catenin在MDS中表达水平的意义,以及与临床特征的关系,旨在探讨Wnt/β-catenin信号通路在MDS发生发展中的可能作用。材料与方法1研究对象研究对象均为2011年4月至2011年12月郑州大学第一附属医院血液科住院或门诊病例。骨髓增生异常综合征患者经血常规,骨髓细胞形态学、免疫学、细胞遗传学以及分子生物学检查,符合骨髓增生异常综合征诊断标准。MDS患者共42例,按WHO分型RA/RN/RT15例,RAS5例,RCMD6例,RAEB-13例,RAEB-210例,RAEB转白3例,按照血液病诊断及疗效标准(张之南沈悌第三版),IPSS积分<1.5则划分为低危组,≥1.5分则划分为高危组,即IPSS积分危度划分中的低危与中危Ⅰ划分为低危组,中危Ⅱ和高危划分为高危组。核型良好定义：正常核型,-Y, del(5q), del(20q);不良：7号染色体异常,复杂核型异常(3种或3种以上异常)。分组如下：(1)骨髓增生异常综合征患者低危组18例,男6例,女12例,中位年龄50岁(30-85岁),RA/RN/RT/13例,RAS3例,RCMD2例；(2)骨髓增生异常综合征患者高危组21例,男7例,女14例,中位年龄54岁(19-79岁),RA2例,RAS2例,RCMD4例,RAEB-13例,RAEB-210例；(3)骨髓增生异常综合征转为白血病组3例,男1例,女2例,均转为急性髓系白血病-M2；(4)对照组14例,男8例,女6例,中位年龄42岁(17-59岁),为同期血液科造血干细胞供者或骨髓正常的非恶性血液病患者。2实验方法1) RT-PCR法检测骨髓单个核细胞β-catenin mRNA水平。取研究对象骨髓标本,分离单个核细胞,TRIZOL法提取细胞总RNA,逆转录成cDNA,后PCR扩增30个循环。琼脂糖凝胶电泳后,紫外灯下照相,所有阳性结果行灰度分析并计算β-catenin/β-actin的比值。2) Western blotting法检测骨髓细胞中β-catenin蛋白表达水平。取研究对象骨髓液离心后加入PIPA裂解液及蛋白酶抑制剂,取适量蛋白应用BAC法定量蛋白,取25μg蛋白经100g/L SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离,考马斯亮蓝检测胶中蛋白电泳效果,电转移至PVDF膜上,PVDF膜室4℃冰箱中25V过夜10h。将膜放入盛有封闭液(5%的脱脂奶粉)的容器中,室温摇床封闭1h。加入一抗鼠抗人β-catenin单克隆抗体,稀释度1：2000,室温下摇床缓慢摇荡孵育2h。用辣根过氧化物酶标记的抗鼠二抗检测蛋白表达。用成像系统进行光密度扫描,对扫描结果进行统计学处理。3数据统计应用SPSS17.0统计软件对实验数据进行分析。定性资料采用卡方检验(包括Fisher’s精确概率试验)。定量资料用平均值±标准差(x±SD)表示：多样本均数的比较采用方差分析,两独立样本均数的比较采用t检验。相关性分析采用Spearman相关性分析,以α=0.05为检验水准。结果1RT-PCR检测β-catenin mRNA阳性率比较：14例对照组阳性率为21.4%,42例MDS患者样本中,18例低危组阳性率为61.1%,21例高危组阳性率为95.2%,3例转白组为100%,四组阳性率差异具有统计学意义(阳性率比较χ2=22.154,P<0.05)。两两进行比较,正常对照组和低危组阳性率差异具有统计学意义(Fisher=0.036,P=0.028<0.05),高危组与转白组阳性率差异无统计学意义(Fisher=1.000,P=0.875>0.05),低危组与高危组差异具有统计学意义(Fisher=0.015,P=0.012<0.05)。表达水平的比较,将正常对照组与低危组,低危组与高危组分别进行独立样本t检验。正常对照组与低危组表达水平t=0.982,P=0.346>0.05,其差异不具有统计学意义。低危组与高危组表达水平t=4.349,P<0.05,其差异具有统计学意义。2Western blotting检测β-catenin表达阳性率比较,14例对照组阳性率为0%,42例MDS患者样本阳性率为54.8%,低危组和高危组的阳性率分别是11.1%和85.7%,转白组病例较少,3例均表现为阳性。四组阳性率比较：χ2=38.03,P<0.05,阳性率表达差异具有统计学意义,其中高危组及转白组的阳性率明显高于低危组及对照组,低危组高于对照组。两两进行比较,低危组和高危组差异具有明显的统计学意义(Fisher=21.038,P<0.05)。而对照组与低危组差异无统计学意义(Fisher=1.607, P=0.308),高危组与转白组差异无统计学意义(Fisher=0.469, P=0.657).蛋白表达水平的比较,将正常对照组与低危组,低危组与高危组分别进行独立样本t检验。正常对照组与低危组,表达水平差异具有统计学意义(t=7.920,P<0.05),低危组与高危组进行独立样本t检验,差异具有统计学意义(t=12.890,P<0.05)。3β-catenin与染色体核型的相关性分析β-catenin mRNA水平与表达预后不良核型相关(χ2=12.986,P<0.05,具有统计学意义),β-catenin蛋白水平与表达预后不良核型相关(χ2=22.380,P<0.05,具有统计学意义)结论1.MDS中β-catenin的mRNA及蛋白表达水平均增高,表示β-catenin可能参与了MDS疾病的发展过程,提示针对β-catenin的靶点治疗有可能成为MDS新的治疗方法。2. β-catenin在染色体预后不良核型的患者样本中呈现高表达,提示可能与预后有关。